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热敏磷酸酶

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更新	2025-08-12 18:55

详细信息

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♦ 除去 DNA、RNA、rNTPs 和 dNTPs 5' 末端的磷酸基团 ♦ 防止克隆载体的自连接 ♦ 蛋白质丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的去磷酸化 ♦ 为 5' 末端标记准备模板 ♦ 去除 PCR 产物中的 dNTP 和焦磷酸盐

概述热敏磷酸酶能催化除去DNA或RNA末端的5′磷酸基团。由于磷酸酶处理后的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自连接(1)。这个特性可以在克隆时降低载体DNA的背景。

来源源于含TAB5 AP 基因的E . coli 菌株，该基因最初克隆于质粒pNI(2)中，后来重新克隆于质粒pEGTAB7-4.1中(3)。

反应条件 10X 热敏磷酸酶反应缓冲液
[50 mM Bis Tris-丙烷，1 mM MgCl₂ ，0.1 mM ZnCl₂ (pH 6.0 @25°C)]。如果反应在 NEBuffer1,2,3,4 或特有Buffer(如：EcoRI Buffer) 中进行，必须在反应体系中补加热敏磷酸酶反应缓冲液至 1X 终浓度。

质保声明无核酸内切酶和外切酶污染。

磷酸酶热失活：在标准反应条件下，加入 10 单位的酶和 DNA，去磷酸化 30 分钟，然后在 65 ℃ 加热。残留的磷酸酶活性用对硝基苯磷酸盐（pNPP）检测。

单位定义 1 单位指在 37 ℃条件下，30 分钟能使1μg 经 HindIII（产生 5' 突出末端）、EcoRV（产生平齐末端）或 PstI（产生 5' 凹陷末端）消化的 pUC19 DNA去磷酸化所需的酶量。去磷酸化标准是指在自连接反应中能抑制 >95% 的 DNA 再环化（通过转化 E.coli 细胞来检测）。

活性检测条件在补加有热敏磷酸酶反应缓冲液的限制性内切酶缓冲液中进行载体 DNA 的去磷酸化。50 ng 载体的连接反应用 NEB 的快速连接试剂盒（NEB #M2200）进行。

浓度 5,000 units/ml。

贮存条件 10 mM Tris-HCl（pH 7.4），1 mM MgCl2，1 mM DTT，0.01 mM ZnCl2 和 50% 的甘油。于 -20 ℃ 贮存。

热失活 65°C 5分钟。

参考文献 (1) Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (p. 5.72). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
(2) Rina, M. et al. (2000) Eur. J. Biochem ., 267, 1230–1238.
(3) Guthrie, E., unpublished observations.

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