孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒
一. 概要
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前检测孔雀石绿的方法有两种：HPLC或GC-MS，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。本试剂盒采用竞争酶标免疫法，同时把隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，可经济、快速地检测鱼、虾、以及鱼池或者鱼缸水样中总的孔雀石绿残留。
二. 测定原理
孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒是利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有孔雀石绿蛋白偶联物。检测时，加入待测孔雀石绿标准品或样品溶液，然后加入特异性的孔雀石绿的抗体一起孵育，溶液中的孔雀石绿跟板上包被的孔雀石绿蛋白偶联物竞争性地与孔雀石绿抗体结合，形成抗原抗体复合物。孵育一段时间后，洗板，加入羊抗鼠辣根过氧化物酶结合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿的浓度与吸收光强度成反比。
三. 试剂盒组成
（1）96孔酶标板：1块（孔雀石绿蛋白偶联物）
（2）标准品6瓶：（1ml/瓶）：0ppb、0.03ppb、0.09ppb、0.27ppb、0.81ppb、2.43ppb。
（3）孔雀石绿高深度标准品24300ppb(备用)…1ml
（4）无色孔雀石绿标准品1000000ppb(备用)0.5ml
（5）抗体工作液(淡红色的液体)………………7ml
（6）酶标二抗(蓝色的液体)…………………11ml
（7）显色液A(红色盖) ………………………7ml
（8）显色液B(蓝色盖) ………………………7ml
（9）终止液(黄色盖) ………………………7ml
（10）20×浓缩洗涤液………………………50ml
（11）样本稀释液………………………………4ml
（12）5×提取液A ……………………………50ml
（13）2×提取液B ……………………………20ml
（14）氧化液……………………………………8ml
（15）氧化铝柱………………………………42支
（16）使用说明书
六、酶联免疫测定程序
测定前须知：
1、使用之前将所用试剂和需用微孔板回升至室温，包括标准品、样品液、洗涤液、需用的微孔板、显色剂、终止液等。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。
测定步骤：

1. 平衡:将所需试剂从冷藏环境中取出（包括标准品、样品液、洗涤液、显色剂、终止液、需用的微孔板），在室温下平衡30min以上，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
2. 配液

洗涤液：1ml 20×浓缩洗涤液+19ml蒸馏水。
3、加样:加标准品或样品液50μl到微孔中，然后加50μl抗体工作液，37℃下避光反应30min。
4、洗板:甩去孔中液体，用洗涤液250ml/孔，洗涤4次，每次间隔5s，用吸水纸拍干.
5、加酶标二抗：加入酶标二抗100ml/孔，轻轻振荡混匀，
置37℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤4。
6、显色：加入显色液A 50ml/孔，再加显色液B 50ml/孔，轻轻振荡混匀，置37℃避光环境反应15min.
7、终止测定:加50μl终止液到微孔板中，在酶标仪于450nm处测定OD值。
8．计算：公司提供了简便准确的软件,可来电垂询.
七、结果
所测得的标准液和样品吸光度的平均值除以第一个标准液（0标准液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0标准液的百分吸光度值等于100%。
标准液的吸光度值（或样品）
-----------------------------------×100 = %吸光度值
0标准液的吸光度值
以标准品浓度的以10为底的对数为X轴，百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含孔雀石绿的量。
八、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.03ppb
样本最低检测限：
鱼/虾等水产品………………………0.5ppb
水样 …………………………………0.03 ppb
回收率：
水样/鱼/虾等水产品
孔雀石绿…………………65±15%
隐性孔雀石绿……………90±15%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
九、特异性
与类似物的交叉反应率：
孔雀石绿 ………………………100%
结晶紫 ………………………91%
隐性孔雀石绿 ………………… 0.4%
隐性结晶紫 …………………＜0.01%
十、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准
曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应
立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需要将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效
期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂
盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用试剂盒中的试剂(各个盒子里的试剂都不允许交叉使用,否则会影响结果的准确性)。
6、储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放质。进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于0.6（A_450nm<0.6 ）时，表示试剂可能变坏。
8、在加入显色剂后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
9、该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十一、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
保存期：本试剂盒有效期为12个月。