SUPERCULTURE 自然杀伤（NK）细胞诱导培养试剂盒3.0说明书Cat#：6813551/6813552/6813553
【产品名称】
自然杀伤（NK）细胞诱导培养试剂盒3.0
【产品描述】
自然杀伤（NK）细胞诱导培养试剂盒3.0是一款GMP级别、无饲养层细胞、适用于NK细胞体外诱导扩增的培养试剂盒，包括NK细胞包被剂、NK细胞诱导剂、NK细胞活化剂、NK细胞培养补充剂和N300 NK细胞无血清培养基。本产品批间质量稳定，用于脐带血体外诱导扩增NK细胞。
【包装规格】
成品名称 成品货号 规格 组分名称 组分规格数量自然杀伤
（NK）细
胞诱导培
养试剂盒
3.0
6813551 3 L体系
NK细胞包被剂
NK细胞诱导剂
NK细胞活化剂
NK细胞培养补充剂
N300 NK细胞无血清培养基300 μL
600 μL
500 μL
42 mL
1 L
1支1支3支1瓶3瓶6813552 2 L体系
NK细胞包被剂
NK细胞诱导剂
NK细胞活化剂
NK细胞培养补充剂
N300 NK细胞无血清培养基200 μL
400 μL
500 μL
28 mL
1 L
1支1支2支1瓶2瓶6813553 1 L体系
NK细胞包被剂
NK细胞诱导剂
NK细胞活化剂
NK细胞培养补充剂
N300 NK细胞无血清培养基100 μL
200 μL
500 μL
14 mL
1 L
1支1支1支1瓶1瓶【储存条件及有效期】
NK细胞包被剂、NK细胞诱导剂、NK细胞活化剂、NK细胞培养补充剂，-15℃~-25℃保存，有效期一年。
N300 NK细胞无血清培养基，2℃~8℃避光保存，有效期一年。【使用方法】
以1L体系为例。
一、样本要求
新鲜/冻存的脐带血单个核细胞（UBMCs）。
二、准备工作
1. T25 包被瓶准备
第-1 天，将 3 mL PBS 与 100 μL NK 细胞包被剂混匀后加入T25 培养瓶中，平放晃匀，铺满瓶底后置于 4℃包被过夜（紧急条件下或 37℃包被 2 h）。包被完成后，吸走多余的包被液，使用 10 mL PBS 轻柔的清洗瓶底待用，注意不要冲刷培养瓶底部。
用于后续制造和实验室使用2 / 4 REV：C/12. 配制 NK 细胞扩增培养基
每 1 L N300 NK 细胞无血清培养基加入 1 支 500 μL NK 细胞活化剂，为NK细胞扩增培养基。NK 细胞扩增培养基于 2℃~8℃避光保存，有效期为三周。3. 配制 NK 细胞激活培养基
取出 25 mL NK 细胞扩增培养基，加入 200 μL NK 细胞诱导剂，配置为NK细胞激活培养基，于 NK 培养中 D0 及 D3 补液使用。
4. NK细胞培养
(1) 第0天，使用10 mL NK激活培养基（含10%自体血浆和10% NK细胞培养补充剂）将UBMCs按2.5~3.0×10
6个/mL的浓度接种于已包被的T25细胞培养瓶中，摇匀细胞后置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
*注意：若脐血中抗凝剂占比过高，可不添加自体血浆进行培养。
(2) 第3天，观察细胞状态，于原来的T25中直接补加15 mL NK激活培养基（含10%自体血浆和10% NK细胞培养补充剂），轻柔补液，勿直接吹打细胞。*注意：T25瓶略微倾斜放置，避免液体溢出瓶口。
(3) 第5天，观察细胞状态，取样计数。若细胞浓度小于1.4×10
6个/mL，则补加25mLNK扩增培养基（含5%自体血浆和5% NK细胞培养补充剂）；若细胞浓度大于1.4×106个/mL，则补加55 mL NK扩增培养基（含5%自体血浆和5% NK细胞培养补充剂）。(4) 第7天，观察细胞状态，取样计数。参照补液程序，补加NK扩增培养基（含2.5%自体血浆和2.5% NK细胞培养补充剂）。
(5) 第9天，观察细胞状态，取样计数。参照补液程序，补加NK扩增培养基（含1%NK细胞培养补充剂）。
(6) 第11天，观察细胞状态，取样计数。参照补液程序，补加NK扩增培养基（含0.5%NK细胞培养补充剂）。
(7) 第14天，观察细胞状态，取样计数。参照补液程序，补加剩余的NK扩增培养基使终体积为1000 mL（含0.5% NK细胞培养补充剂）。
(8) 第16~18天，观察细胞状态，拍照、取样计数细胞浓度，收集细胞作后续使用。*注意：
① D0、D7、D17 天流式测阳性率，可根据细胞生长状况适当提前或延迟收获时间。② 脐血来源的 NK 细胞体外扩增效果因供体而异，上述的培养方案是经优化后较为稳定的培养程序。因 NK 供体的差异，导致 NK 细胞可能比预期的扩增更快或更慢，建议培养周期中仔细观察细胞生长状况，灵活调整补液和收集步骤，以充分发挥试剂盒的体外扩增性能。 附：脐血单个核细胞分离方法
1. 向 50 mL 离心管中倒入抗凝全血，700 g 离心 15 min（升速8 降速4），转移血浆层至新的离心管中，于 56℃灭活 30 min，900 g 离心 10 min，上清于-20℃放置20 min，再次900g 离心 10 min，上清于 4℃保存待用。
2. 向下层红色液体中加入与灭活血浆同等体积的 PBS，混匀后按照全血体积：红细胞沉降液 3:1 ~ 4:1 的比例加入红细胞沉降液沉降 30 min 左右，直至血浆：RBC 之间的界面在约占总体积 50%的位置，取出沉降上清于 50 mL 离心管中，颠倒混匀。3. 取一定体积（分离液与沉降上清的体积比为 1 : 1）的分离液于离心管中，将上清平铺到分离液液面上方，800 g，20℃ 离心 20 分钟（升速 3 降速3）后，得到高纯度的单个核细胞层。
4. 吸取中间 UBMCs 白膜层，使用 50 mL 的 RPMI 1640 洗涤2 次（250 g，10 min，20℃），用 5 mL 的 RPMI 1640 将 UBMCs 重悬，稀释后计数，即得到UBMCs。
用于后续制造和实验室使用3 / 4 REV：C/1表1 补液参考程序
时间
培养容
器
培养基
补液体
积
血浆体
积
NK 细胞培养补充剂总体积备注D -1 T25 / / / / / 4℃包被过夜D 0 T25 激活培养基 8 1 1（10%）10
接种密度2.5~3.0*106个/mLD 3 T25 激活培养基 12 1.5 1.5（10%）25
勿吹打细胞，避免干扰细胞正常激活D 5 T175 扩增培养基 22.5/49.5 1.25/2.75 1.25/2.75（5%）50/80 控制补液后密度在0.5~1.0*106个/mLD 7
T175/
培养袋
扩增培养基 95/152 2.5/4 2.5/4（2.5%）150/240
D 9 培养袋 扩增培养基 150/160 0 1.5/1.6（1%）300/400 控制补液后密度在1.0*106D 11 培养袋 扩增培养基 250 0 1.25（0.5%）550/650 个/mL左右D 14 培养袋 扩增培养基 450/350 0 2.25/1.75（0.5%）1000 加入剩余培养基D16/
D18 培养袋 扩增培养基 / / / 1000 收集细胞【注意事项】
 本品避免反复冻融，使用时注意无菌操作。
 NK细胞培养补充剂可支持NK细胞的高效扩增，放置于37℃解冻，分装后按照一定比例添加至培养基中使用，勿反复冻融。
 建议初始接种密度为2.5~3.0*10
6 个/mL，冻存UBMC可提高至3.0~3.5*10
6 个/mL。过高或过低的接种密度会影响NK细胞扩增效果。
 使用PBS稀释NK细胞包被剂后于4℃平放过夜。（紧急情况下可37℃包被2小时） 使用前，培养基室温平衡，或取出当天预计用量，预温至37°C，请勿整瓶培养基放置37°C反复预温。
 细胞传代操作需轻柔，避免造成细胞机械性损伤。
 3L体系适用于7.5~9.0×10
7 个UBMCs；2L体系适用于5.0~6.0×10
7 个UBMCs；1L体系适用于2.5~3.0×10
7 个UBMCs。
 NK细胞培养扩增前期呈现聚团生长，尽量轻柔补液，不可晃动细胞，避免干扰NK细胞的正常激活。同时注意，D0及D3使用NK激活培养基，后续使用NK扩增培养基。 NK细胞进入培养袋培养后，建议根据培养体积对折培养袋使用。