小型近红外(NIR)荧光蛋白(FPs)作为蛋白质标签在成像应用中发挥非常需要的作用。

芬兰赫尔辛基大学Vladislav V. Verkhusha团队在《Nature Methods》上发表《Single-domain near-infrared protein provides a scaffold for antigen-dependent fluorescent nanobodies》一文，首次提出一种17 kDa NIR FP，称为miRFP670nano3，它可以在哺乳动物细胞中发出明亮的荧光，并实现深部脑成像。另外，通过探索miRFP670nano3作为内部标签的功能，作者构建了32 kDa NIR荧光纳米抗体，称为NIR-Fbs，其稳定性和荧光强度依赖于细胞内特定抗原的存在。

NIR-Fbs允许对内源性蛋白质进行无背景可视化，检测病毒抗原，标记表达靶分子的细胞以及用双特异性NIR-Fbs鉴定表达两种抗原的双阳性细胞群。应用NIR-Fbs作为不稳定融合伴侣，研究人员还开发了用于定向降解靶蛋白，调控蛋白表达和酶活性的分子工具。总之，NIR-Fbs能够基于细胞内蛋白质谱来检测和操控各种细胞过程。

案例解析

 在体大脑和脊髓双光子成像 

为了评估miRFP670nano3在体内成像中的应用，作者将其克隆为携带hSyn启动子的腺相关病毒(AAV)载体。将载体注射到Cx3cr1^GFP/+小鼠的躯体感觉皮层或脊髓背角中，3-5周之后进行双光子成像，结果发现miRFP670nano3在神经元细胞中发出明亮的荧光，而无需外部BV。EGFP的最佳激发波长920nm成像时，整个皮层直到内嗅皮层(约850μm)都能见到miRFP670nano3阳性细胞。研究表明，miRFP670nano3能在哺乳动物细胞中发出明亮的荧光，可用于体内深部组织成像。

图1. 小鼠在体脑和脊髓多重双光子成像

双特异性NIR-Fbs用于标记双阳性细胞 

此外作者还构建了一种双特异性融合体，可以结合两种不同同源抗原EGFP和mCherry的NIR-Fbs(图3a)。研究发现，只有当EGFP和mCherry共表达时产生miRFP670nano3荧光，表明双特异性NIR-Fb_GFP–NIR-Fb_mCherry通过与两种抗原结合来稳定结合。相反，当NIR-Fb_GFP–NIR-Fb_mCherry单独与EGFP或mCherry共表达时，NIR荧光下降>10倍，表明双特异性融合体被降解(图3b,c)。因此，双特异性NIR-Fbs允许对表达两种目的抗原的双阳性细胞群进行特异性标记。

图3. 双特异性NIR-Fbs标记双阳性细胞

上述miRFP670nano3荧光蛋白产品

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