蛋白质免疫印迹法 (Western Blot ) ,简称WB ,是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开,然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上,利用抗原抗体的特异性结合,用特异性的一抗结合目标蛋白,用HRP标记的二抗结合一抗,再加以ECL发光液显色,检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析,还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
实验流程:
蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-结果分析;
送样要求:新鲜组织:
0.1g新鲜组织至少、液氮或-80℃保存、干冰运输
细胞样本:
1、贴壁细胞:每1×106个细胞(至少)
胰酶消化:吸去培养板内的培养基,用胰酶将细胞消化后,收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
细胞刮子收集细胞:对于某些蛋白(即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求,如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测),直接用细胞刮子刮下细胞,收集到EP、15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用,建议尽快检测。
2、悬浮细胞样品:把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。避免冻融,尽快检测
提供结果示例: