小鼠 Kupffer 细胞分离试剂盒产品描述

Cat NO: IMP-MK005

Kupffer 细胞(Kupffer cells ，KCs)，亦称为肝巨噬细胞，是位于肝脏中的特殊巨噬细胞，同时也 是单核吞噬细胞系统的一部分。KCs 通过模式识别受体识别外源和内源的危险信号，激活后分化为 M 1 型和 M2 型。KCs 在肝脏的基本功能包括：吞噬清除病原;抗原递呈,启动适应性免疫;促进肝细胞再生等。 该试剂盒采用二步灌流法+水浴消化法，结合生物素抗体-链霉亲和素磁珠进行阳选，可快速纯化得到 小鼠肝脏 Kupffer 细胞。使用本试剂盒提取所得的小鼠原代肝脏 Kupffer 细胞纯度>90.0%，纯化后可直 接进行 RT-qPCR、Western blot 等基本生物学实验，贴壁后可进行药理、病理、毒理学、免疫染色等实 验操作。

小鼠 Kupffer 细胞分离试剂盒适用范围

该试剂盒适用于 C57BL/6J、BALB/c 等不同品系 6 周龄以上小鼠的原代肝脏 Kupffer 细胞提取试剂 盒。

小鼠 Kupffer 细胞分离试剂盒规格

本试剂盒规格为 10 次(以 1 只 6 周龄以上小鼠为 1 次计，约得到 5×105-7×105 个细胞)

小鼠 Kupffer 细胞分离试剂盒运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为 6-8 周，建议尽快使用。

小鼠 Kupffer 细胞分离试剂盒配套培养基信息

表 1. 试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：将小鼠肝脏 Kupffer 细胞灌注液 Ⅰ 、灌注液Ⅱ、消化液置于水浴锅中加热至37℃ , 备用。实验需自备蠕动泵(若无蠕动泵，选择方案二，但效果不如方案一好)、注射器、静脉留置针、 手术器械、75 μm 过滤筛、培养皿、离心管若干、磁力架(推荐配套购买我司的磁吸分离器：IMP-IN001)。

一、肝脏消化

方案一：

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。

2.将蠕动泵的软管冲洗完毕后，软管一端置于预热好的肝脏 Kupffer 细胞灌注液 Ⅰ 内，软管另一 端与静脉留置针相连接并设置好灌流速度为 5 mL/min。

3.剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

4.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好 位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，启动蠕动泵进行灌注。

5 .当见到肝脏充盈，立即剪开门静脉引流，保持至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄色为止。

6.换上肝脏 Kupffer 细胞灌注液 II ，将灌流速度改为3 mL/min 。并用棉签节律性按压门静脉切口 (挤压 5-10s 左右，间隔 30s-1 min ，让肝脏略微充盈，提高消化率)，消化肝脏直至用棉签按压肝脏 有塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹。

7 .将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来置于装有细胞洗液的培养皿中，转移到超净台中清洗一遍。将 清洗后的肝脏组织转移至新的装有小鼠肝脏 Kupffer 细胞消化液的培养皿，用镊子小心去除胆囊和肝脏 外的包膜，轻轻撕裂肝组织使肝脏混合细胞散落至培养皿中，未完全分散的部分及肝总管用镊子轻轻 拨碎至肝脏 Kupffer 细胞消化液中。

8.将培养皿中的肝混合细胞及消化液收集于 50mL 离心管中，37℃水浴消化 20 分钟。

9.用 3-4 倍体积的细胞消化终止液终止消化。

方案二：

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。

2.将装有肝脏 Kupffer 细胞灌注液 Ⅰ 的注射器的射端(不需要用到针头)与静脉留置针相连接。

3.剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

4.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好 位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，手推压注射器进行灌注，保 持灌流速度为 5 mL/min。

5 .当见到肝脏充盈，立即剪开门静脉引流，保持至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄色为止。

6.换上肝细胞灌注液 II，将灌流速度改为3 mL/min。并用棉签节律性按压门静脉切口(挤压5-10s 左右，间隔30s-1 min,让肝脏充盈，提高消化率)，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有塌陷感或者部分透 明感，条纹样的裂纹。

7 .将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来置于装有细胞洗液的培养皿中，转移到超净台中清洗一遍。将 清洗后的肝脏组织转移至新的装有小鼠肝脏 Kupffer 细胞消化液的培养皿，用镊子小心去除胆囊和肝脏 外的包膜，轻轻撕裂肝组织使肝脏混合细胞散落至培养皿中，未完全分散的部分及肝总管用镊子轻轻 拨碎至肝脏 Kupffer 细胞消化液中。

8.将培养皿中的肝混合细胞收集于 50mL 离心管中，37℃水浴消化 20 分钟。

9.用 3-4 倍体积的细胞消化终止液终止消化。

二、肝脏 Kupffer 细胞分离纯化

1. 用细胞洗液润洗 75 μm 筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液用宽头吸头或者巴氏管移 至筛网上方过滤。

2. 4℃ , 300 xg 离心 10 分钟。

3. 弃去上清，用细胞洗液进行重悬，离心：4℃ , 50 xg ，5 分钟。

4. 吸取大部分上清至新的离心管中(细胞沉淀为肝实质细胞)，将细胞悬液进行离心：4℃ , 50 xg ，5 分钟。

5. 吸取大部分上清至新的离心管中(细胞沉淀为肝实质细胞)，将细胞悬液进行离心：4℃ , 300

xg ，10 分钟。

6. 弃去上清，用 100uL 分选 Buffer 重悬细胞。(经验一只鼠约 2×107 个非实质细胞，包含碎片 )

7. 将 100μL 细胞悬液(以一只鼠的非实质细胞为例)加入离心管底部，再加入2 μL 分选试剂， 混匀后于 4℃孵育 15 min，期间每隔 5 min 轻弹离心管管壁使抗体和细胞混合均匀。

8. 孵育完成后，加入 1 mL 分选 Buffer 重悬，离心：500 g ，离心 5 min。

9. 用 100 μL 分选 Buffer 重悬细胞，加入 10 μL 肝脏 Kupffer 细胞分选磁珠(使用前涡旋振荡重 悬磁珠，确保磁珠完全重悬)，混匀后 4℃孵育 10 min ，期间每隔 5 min 轻弹离心管管壁，使磁珠和细 胞混合均匀。

10. 孵育完成后，加入 1 mL 分选 Buffer 重悬，离心：500 g ，离心 5 min

11. 用 1 mL 分选 Buffer 重悬细胞，将含有细胞的离心管置于磁力架上，静置 5 min ，待磁珠被吸 附后，在磁力架上小心弃去液体部分(即非目的细胞)，保留磁珠吸附部分(即肝脏 Kupffer 细胞)。

12. 取出离心管，用 1mL 分选 Buffer 重悬磁珠吸附部分的细胞，重复步骤 112-3 次

13. 用肝脏 Kupffer 细胞专用培养基重悬细胞后即可调整细胞密度进行种板。(1 只 8W 小鼠约种 1 个 12 孔)

注意事项

1. 肝脏灌注液在灌注肝脏过程中需保证温度稳定在37℃。

2. 肝脏离体后建议在冰上操作，分散肝脏 Kupffer 细胞时应避免使用尖头吸头、过度重悬等操作 导致细胞机械损伤。

3. 肝脏水浴消化的时间可以根据肝脏灌注情况适当调整，但不建议超过 30 分钟。

4. 该分离试剂盒建议与逸漠生物磁力架配套使用，若使用分选柱进行分选的话可能会导致细胞 数量少、状态不佳等。

5. 小鼠肝脏 Kupffer 细胞分离试剂盒中的产品含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作 台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。