游离DNA (Cell Free DNA)

液态活检和无创检测的出现导致许多新的游离DNA（cfDNA）检测方法的发展。

液态活检能够对在几滴血液或血浆中的DNA进行测序。与传统的活检不同，液态活检大部分是非侵入性的，是诊断或监测诸如癌症这类疾病的便利技术。

从生物体液（例如血液，血浆和尿液）中提取游离DNA是具有挑战性的，因为它们一般是含量较低且高度片段化的DNA。对于游离DNA的研究是为了能够鉴定非常低等位基因频率下的遗传变异，低至0.1％或更低，这对许多当前技术的检出限是一个挑战。

核酸结构变异（基因易位，融合，拷贝数变异和大范围的插入、缺失）的检测也具有挑战性，生物信息学流程的持续发展来促进结构变异的检测。在高度重复区域（富含GC或AT区）中检测SNV和小范围的插入、缺失是困难的，因为外显子和靶向捕获数据中的覆盖深度特别易受到GC偏差、捕获探针边界附近的不均匀覆盖以及其他系统偏差等的影响。

cfDNA性能分析

Horizon开发了参考标准品以支持包括NGS，ddPCR和qPCR在内的各种平台上对cfDNA工作流程的推进和持续评估。这些高通量平台为研究人员在对cfDNA样品进行分析时可提供更好的支持，然而在应用于生物标记物中的检测时，仍旧需要进一步考虑养样本的多样性以及平台差异性。

因此，有一个独立的质控是很重要的，使研究者能够保证研究的性能，包括检测的灵敏度、特异性以及游离DNA研究方法及平台的精确度。Horizon的参考标准品是为了满足这一需求而制定的。

cfDNA参考标准品

这些标准品由工程化的人类癌细胞系合成的，为游离DNA工作流程的评估提供稳定、可再生的资源。cfDNA标准品是由160bp左右的片段化核酸组成，类似于从人血浆中提取的cfDNA（参见图1）。

图1. 通过D1000 DNA ScreenTape法检测的cfDNA参考标准品的片段大小实例。

注意：以25bp为中心的左峰代表固有标准品，片段化的cfDNA标准品则由较大的右峰表示。

Horizon cfDNA参考标准品可用于多种混合物以解决特殊的测定挑战，包括在cfDNA检测中检测特异性的评估、检出限以及结构变异的检测等。

cfDNA产品

参考标准品	描述	主要应用
合成血浆中的多重参考标准品	合成血浆中的多重标准品包含4个常见突变基因中8个肿瘤相关位点的突变 一套标准品中包含3支低等位基因突变频率（5％，1％和0.1％）和1支野生型的标准品	•对于NGS及ddPCR用于ctDNA低频突变（低至0.1％AF）验证及研究整个过程的质控 •评估ctDNA检测的特异性和灵敏度 •用野生型来评估ctDNA检测的灵敏度
多重参考标准品	多重标准品包含4个常见突变基因中8个肿瘤相关位点的突变 一套标准品中包含3支低等位基因突变频率（5％，1％和0.1％）和1支野生型的标准品	•验证和研发新的用于ctDNA低频突变（低至0.1％AF）验证和研究的方法 •评估ctDNA检测的特异性和灵敏度 •用野生型来评估ctDNA检测的灵敏度
BRAF V600e参考标准品	肿瘤相关突变体的单基因位点突变 一套标准品中包含3支低等位基因突变频率（5％，1％和0.1％）和1支野生型的标准品	•验证和研发新的用于ctDNA低频突变（低至0.1％AF）验证和研究的方法 •用匹配野生型评估ctDNA检测的灵敏度 •产生标准曲线以确定ctDNA的检出限
结构变异参考标准品	包含8个常见突变基因的10个肿瘤相关突变位点 单管含有等位基因频率为4.8-5.6％和拷贝数变异（CNV）为4.5-9.8倍的片段DNA	•验证和开发检测ctDNA结构变异的新方法 •评估基因组对变异检测的影响 •分析您的生物信息学流程对结构变异检测的稳健性

福尔马林处理DNA (fcDNA)

福尔马林的影响是实验室中非常难以控制的一个因素。从生物库里收到的样本可能被不同的操作人员以不同的方式处理，包括不同的福尔马林处理时间，从而导致差别迥异的DNA质量。类似地，甲基化和脱氨基化可导致测序错误，产生的片段化可能会影响后续定量和提取产量，而这种对质量的影响，会使DNA在文库制备和PCR阶段的扩增变得更加困难。FFPE组织经过片段化和化学修饰后，在分子研究中的应用变得更具挑战性。

当将FFPE与冷冻样品进行比较时，来自FFPE样品的NGS数据显示其具有较小的文库插入片段大小，更大的覆盖变异性和CpG中的C较多的转为T，可能是由DNA的甲基化和福尔马林的诱变的相互作用引起的。

图1.福尔马林固定和新鲜冷冻组织标本的临床靶向NGS数据对比 (Spencer 2013)

类似的，Hedegaard et al. (2014) 进一步表明，三个月的储藏会导致DNA的提取效率降低，主要因为：

• 高度片段化化：DNA的丢失

• 文库的复杂性降低

• PCR重复率高度增加，福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）样本为60 - 85％，新鲜冷冻（FF）样本仅为30％

结果显示，FFPE与小于三年的新鲜冻存样本之间有70-80％的一致性，但是当样本超过三年时一致性会显着下降。

图2.来自新鲜冻存样本和 FFPE样本的DNA-Exome-Seq数据中检测到的单核苷酸突变。常规突变（灰色），新鲜冻存样本特异突变（白色）和FFPE样本特异突变（红色）百分比以柱状图呈现并在左轴显示。平均覆盖率显示在右轴并用新鲜冻存样本（白色）和FFPE（红色）星号标记。患者ID和储存年数在以下文章中显示。

Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.Hedegaard 2014