产品名称：miRNA 加尾法逆转录试剂盒

产品用途：适用于短片段RNA（主要为 miRNA）的加尾法逆转录反应，反应产物 cDNA 主要用于 PCR、qPCR 等反应。

 产品描述：

本试剂盒采用Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行的方法来进行miRNA第一链cDNA的合成，包含了与此配套的通用型qPCR反向引物（Universal 3’qPCR Primer），仅需自行设计一条目的miRNA的特异性正向引物，就能够用于miRNA的定量检测。具体过程是：先通过Poly(A) Polymerase在miRNA的3’末端加Poly(A)尾，再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA的cDNA第一链。

本试剂盒为包含去除基因组DNA的高效DNase的快速逆转录试剂盒，主要含有4管试剂：gDNA Remover、miRNA RT Enzyme Mix、4× miRNA RT Buffer、Universal 3’qPCR Primer、U6 Primer。其中，gDNA Remover中主要包含浓缩的DNase和buffer，仅需室温（19~27℃）反应5 min，就能降解95%以上的基因组DNA，极大地降低了残留基因组对结果的干扰。

miRNA RT Enzyme Mix中主要包含了Poly(A) Polymerase、逆转录酶、RNase Inhibitor。其中的Poly(A) Polymerase不但具有高效的加Poly(A)尾效率，还特异性识别成熟的单链miRNA，从而避免了具有双链结构的miRNA前体的逆转录反应；逆转录酶采用新型M-MLV突变体逆转录酶，具有很强的抗干扰能力及扩增能力，扩增效率优异。

4×miRNA RT Buffer包含了miRNA加Poly(A)尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，包括Oligo(dT)- universal tag通用逆转录引物、buffer和dNTPs，并经过精心优化，可保证miRNA 3’末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。

产品组成：

产品优势：

专注于外泌体提取和配套试剂盒研发；

性价比高，为您的研究开展节省成本；

数百篇参考文献让您放心使用无忧购；

质控数据：

产品使用：

1、 使用前将各组分从冰箱中取出，冰上融化，上下颠倒5~10次使之充分混匀，然后使用离心机短暂离心将管壁上附着的液体甩下来，置于冰上待用。

去除基因组DNA反应：

2、 用gDNA Remover处理RNA：取100 ng~1 μg总RNA或10 ng~20 ng miRNA（一般建议用0.5 μg的总RNA），加入1 μL的gDNA Remover，加ddH₂O补足10 μL，用移液器轻柔吹打10次左右使之充分混匀，使用离心机短暂离心至管底，然后室温（19~27℃）反应5 min，反应结束后置于冰上待用。

逆转录反应：

3、 按照如下体系配制加尾和逆转录同时反应体系：

4、 按照上表加好试剂后，必须用移液器轻柔吹打10次充分混匀（注：混匀时建议将移液器刻度调到18 μL左右），然后使用离心机短暂离心至管底。

5、 逆转录反应程序：37℃反应15 min，42℃反应10 min，95℃反应3 min，即可得到包含所有miRNA的cDNA第一链。

6、 逆转录反应得到的cDNA可直接作为模板进行qPCR反应，或者稀释5~10倍后再使用（具体的稀释倍数根据基因表达丰度来确定）。在20 μL的qPCR反应体系中：如果模板cDNA稀释10倍，建议使用5 μL的cDNA（2~8 μL）。如不立即进行qPCR实验，建议将cDNA冻存于-80℃冰箱中。

miRNA的qPCR上游引物的设计：

1、 在miRNA数据库网站上搜索得到目的miRNA成熟体序列。

2、 复制目的miRNA序列，将其中的U改成T，然后去掉3’端的最后6个碱基。

3、 在5’端加上3~6个碱基（目的是提高引物的Tm值，加入的序列以GC为主，例如CGGGC，GCGGGC，A/TGCCCG等），使上下游引物的Tm值相近，得到最终的正向引物序列。

常见的注意事项、操作要点及优化方法：

1、 实验开始前首先验证qPCR引物是否适用，主要观察扩增曲线与熔解曲线；

2、 引物验证后应分装冻存，防止污染或降解；

3、 miRNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响，应尽量保证miRNA不降解。RNA提取后应尽快进行逆转录反应，避免反复冻融，或者多次逆转录反应。如果预计使用量较大，则可以一次多逆转录几管cDNA。如果条件允许，cDNA建议保存在-80℃冰箱。