Language
一些实验需要定量检测血清、血浆或细胞上清液中存在的人IgG含量，最常用的方法是ELISA。但是ELISA需要多次洗涤，时间比较长操作比较多，且灵敏度一般。Poly-Dtech开发了一款TR-FRET 试剂盒来检测人IgG含量，提高了检测的特异性和灵敏度，且不需要洗涤，节约了时间。
在 Bright-Dtech™ TR-FRET 方法中，使用两种抗体来检测人 IgG。第一个抗体与我们的荧光纳米颗粒（供体）偶联，第二个抗体与荧光分子（受体）偶联。如果两种抗体都识别靶标，则供体的荧光强度将转移到受体，并使用时间分辨荧光读数器检测信号，将背景信号降到最小，以提供特定的定量结果。
一、供体/受体混合溶液的制备
1. 对偶联的纳米颗粒 Bright-Dtech™ 供体抗体进行超声处理（或涡旋），使溶液均匀
2. 将 2970 μL TRF Buffer 添加到含有 24 μL Bright-Dtech™ Donor 抗体储备液的小瓶中并涡旋。
3. 向该溶液中添加 5 µl 受体抗体并涡旋。
二、稀释标曲：
1. 使用前短暂离心“标准溶液”管。
2. 使用“TRF 缓冲液”稀释“标准溶液”制备 2455 ng/mL 的标准品。准备标准曲线的连续稀释液，如图所示。
3. 稀释后的标准品应立即使用，不得储存以备将来使用。
三、样本准备：
-
对于血清和血浆样品稀释：使用 TRF 缓冲液
-
对于细胞培养上清液样品稀释：使用 TRF 缓冲液
-
正常血清/血浆的建议稀释度：5000-10000 倍。
-
请注意，不同样本之间的目标蛋白水平可能有所不同。每个样品的最佳稀释因子必须由研究者确定。
1. 添加 30 µL 标准品或 30 µL 样品。
2. 在每个孔中添加 100 μL 供体/受体混合溶液。
3. 封板。
4. 37°C 孵育 2.5 小时。
5. 除去封板膜。
6. 使用 TR-FRET 兼容酶标仪读取 535 nm 和 520 nm 处的荧光（在 340 nm 处激发）。
一些参数仅供参考，具体参数需根据读板仪调整：
数据分析及计算：
-
TR-FRET 数据使用以下公式计算：
-
通过在 Y 轴上绘制每组重复或三次标准品的比率与 X 轴上相应的人 IgG 浓度的比率来创建标准曲线。
-
可以根据使用四参数或五参数逻辑（4PL 或 5PL）曲线拟合（具有可变斜率的 S 形剂量反应曲线）的非线性回归来确定最佳拟合标准曲线。为此，我们建议使用商业软件程序。
-
要确定样品中未知的人 IgG 浓度，请找到未知的 RATIO 值，将其代入标准曲线方程中并找出预期浓度。如果样品已被稀释，则必须将标准曲线上读取的浓度乘以稀释倍数。
-
产生的信号强度与样品中存在的抗原浓度成正比。
-
任何未稀释或稀释后读数大于（或低于）最高（或最低）标准的样品应使用“TRF 缓冲液”适当稀释并重新测试。
下面的标准曲线仅供参考，不应用于计算未知样品的结果。不同 TRF读板仪的结果可能有所不同。
每次测定都必须制作新的标准曲线。
-