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维生素D是指维生素D2(或麦角骨化醇)和维生素D3(或胆骨化醇)的通称。皮肤暴露在日光紫外线下时,人体可自然产生维生素D3。维生素D3和维生素D2也可通过食物膳食补充摄入。维生素D3主要在肝脏中代谢为25-羟基维生素D3（25OH D3）,是维生素D在体内循环的主要形式。25-羟基维生素D3是其他维生素D代谢物的前体，具有一定的生物活性。而主要的活性物是1,25-二羟基维生素 D3，在肾脏（或胎盘）内，由25-羟基维生素D3羟基化生成。25-羟基维生素D有促进肠道钙、磷的吸收以及骨吸收和矿化作用。并在其他组织器官（胎盘，肾脏，乳腺等）和内分泌腺（甲状旁腺，β细胞等）中负责钙转运。
维生素D2的代谢过程与D3相似,共同维持个体的维生素D状态。在诊断维生素D缺乏、不足或中毒时，测量这两种25-羟基维生素D形式是非常重要的。维生素D缺乏可能导致佝偻病，骨软化症,老年性骨质疏松症，癌症及妊娠反应。检测25-羟基维生素D的两种形式，可以确认血钙浓度是否异常。维生素D中毒可引起肾脏和组织损伤。
该试剂是一个在微孔板上进行的酶联免疫试验。第一阶段，室温孵育2小时，校准品，质控品和样品中的25-羟基维生素D(D2和 D3 ) 脱离结合的血清蛋白,并与特异性的单克隆抗体结合。洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP），室温下孵育30分钟。孵育过程中生物素标记的25-羟基维生素D与未标记的25-羟基维生素D2和D3竞争单克隆抗体上的结合位点。洗板后，加入显色溶液（TMB）孵育15分钟。最后加入终止液停止反应并在适当的波长下读取吸光度。底物的量是通过测量吸光度来决定的，吸光度值与25-羟基维生素D（D2和D3）的浓度成反比。
绘制校准曲线，样品中25-羟基维生素D（D2和D3）的浓度由校准曲线插入值决定。
