亲和层析

亲和层析是基于生物分子与其他配基分子之间（如抗原与抗体、酶与底物、激素与受体、核酸中的互补链、多糖与蛋白复合体等）的特异性吸附原理建立和发展起来的。通过介质上的配基与目标分子之间的特异性吸附来实现纯化目标分子的目的。由于这种特异性的作用力，亲和层析具有高度选择性、高活性回收等特点。
亲和层析介质是在交联琼脂糖上连接不同亲和配基构成的介质，按配基不同又分为多种类型。

 

His标签蛋白纯化

His标签蛋白纯化过渡态金属离子（Cu²⁺>Ni²⁺>Zn²⁺>Co²⁺）能够与电子供体，如N、S、O等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中会被水分子或阴离子占据，当蛋白质表面氨基酸残基（His）与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子就会与金属离子结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使蛋白质分子结合在固体表面。His标签蛋白的His和介质结合，由于蛋白质表面的氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而具体使用时根据金属配基的亲和力大小不同，选择不同的金属配基进行分离纯化。

根据螯合方式不同，又分为IDA,IMAC,TED三种。

 

-应用案例

Ni Focurose FF(TED)纯化His标签蛋白
样品1：His标签蛋白
样品2：His标签蛋白(含0.1M EDTA)
样品3：His标签蛋白(含0.1M EDTA+0.01M DTT)

 

柱子：HT01,1.0mL
平衡液：0.05M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0
洗脱液：0.05M Tris-HCl,0.5M咪唑,0.5M NaCl,pH8.0
上样流速 0.5mL/min , 其它流速 1mL/min

 

Ni Focurose FF(IDA)纯化重组新冠抗原（His标签）

平衡液：20mM PB, 0.15M NaCl，pH7.5
洗脱液：20mM PB, 0.15M NaCl, 500 mM咪唑，pH7.5

 

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GST标签蛋白纯化

GST（谷胱甘肽转移酶）能特异的与谷胱甘肽结合，表现为酶和底物的作用原理，利用这个原理，将GST做成标签表达出融合蛋白，与谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合，从而纯化出目标蛋白。GST融合蛋白纯化的特点是：纯度高，纯化条件温和保持蛋白活性，促进蛋白可溶性表达等。

 

-应用案例

GST Focurose 4FF纯化GST标签蛋白
样品：GST标签蛋白
柱子：HT01,1.0mL
平衡液：0.05M Tris-HCl,0.14M NaCl,pH7.3
洗脱液：0.05M Tris-HCl,0.01M GSH,pH8.0
上样流速0.5mL/min，其它流速1mL/min

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丝氨酸蛋白纯化

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抗体纯化

将Protein A和Protein G等物质偶联在高强度交联琼脂糖上，广泛用于抗体的纯化。

-应用案例
亲和、离子两步法纯化鼠源IgG抗体（中试）
arProtein A Focurose HR在大规模样品制备（层析柱规格7.0cm×24cm）时，压力维持在0.20Mpa以下；重复三次样品制备，填料性能表现良好，收率均在93%以上。纯度、HCP、HCD及其内毒素均满足要求。
第一步：arProtein A Focurose HR亲和捕获目标IgG

 

第二步：Q Focurose FF阴离子精纯

 

Protein G Focurose 4FF纯化人血中IgG

样品：5倍稀释(用不同的两种缓冲液)的5mL人血清
柱子：HT01,1.0mL
平衡液：1＃(0.02M PB,pH7.0)
              2＃(0.02M PB,0.3M NaCl,pH7.0)
洗脱液：0.1M Glycine-HCl,pH2.7
上样流速 0.25mL/min , 其它 1mL/min

 

 

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预活化介质

预活化介质也称为亲和介质活化中间体，是在各种交联强度琼脂糖的基础上，通过不同的偶联方法键合上不同的活性基团（活性间隔臂）。通过活性基团可进一步偶联各种配基，用于制备其它介质（主要是亲和介质）及固定相应物质，用户可根据自己需求把待偶联的配基很容易地偶联上去，避免了前期接活性基团的繁琐工序。

-应用案例
CNBr Focurose 4FF偶联人IgG纯化重组Protein G
样品：大肠杆菌表达的重组Protein G
柱子：HT01,1.0mL
平衡液：0.02M PB,0.15M NaCl,pH7.4
洗脱液：0.05M柠檬酸盐缓冲液,pH3.0

 

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