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产品信息
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） | 促销价（元） |
| MycAway™ Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit 支原体qPCR检测试剂盒（探针法） | 40618ES05 | 5 T | 855 | 595 |
| 40618ES25 | 25 T | 4155 | 3155 | |
| 40618ES60 | 100 T | 13855 | 10355 |
产品描述
MycAway™ Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit 作为精确支原体检测试剂盒，可用于确定如细胞库、病毒种子、临床治疗用途的细胞和生物制品中是否存在支原体污染。本试剂盒采用荧光探针qPCR法技术，定性检测待测样本中支原体DNA，可覆盖100多种支原体DNA序列；具备高灵敏、高特异、高效率、安全高等优势，严格按照EP2.6.7和JPXVII支原体检测相关标准要求进行验证。
本试剂盒包含内部质控（IC），可用来判断待检样本中是否包含对扩增反应存在抑制的因素，从而达到防止假阴性结果的产生；内部质控（IC）也可在样本提取阶段加入，以评估提取效果。本试剂盒与支原体DNA提取纯化试剂盒配套使用，高效提取样本中的支原体DNA，检测限可达到10 CFU/mL，最高灵敏度可达1 CFU/mL。
产品组分
| 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | ||
| 40618ES05 (5T) | 40618ES25 (25 T) | 40618ES60 (100 T) | ||
| 40618-A | 4×MyqPCR Reaction Buffer | 50 μL | 250 μL | 1 mL |
| 40618-B | MyPrimer&Probe MIX | 5 μL | 25 μL | 100 μL |
| 40618-C | 内部质控（IC） | 5μL | 25 μL | 100 μL |
| 40618-D | 阳性质控（PC） | 100 μL | 500 μL | 2 mL |
【注】：阳性质控（PC）浓度为1000copies/µL。
运输储存方法
干冰运输。-20℃保存，有效期一年。
注意事项
1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。
2）加样和配液步骤都尽量在冰上操作。
3）每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途。
适用机型
PRISM® 7500Real-Time PCR System、QuantStudio™ 5（ABI）；CFX96（Bio-Rad）
实验设计
一、待测样本DNA提取
建议使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit提取样本DNA。
二、qPCR反应体系的准备
1）根据所要检测样本的数量，计算所需反应孔数，一般做2个重复孔。
反应孔数=（1个阳性质控PC+1个无模板对照NTC+N个待测样本）×2
2）根据表1反应体系，将所需试剂放冰上融化。
3）根据反应孔数计算所需要的qPCR Mix的量。
Mix=（反应孔数+2）*（10+1+1+8）（包含加样损失）
表1. 反应体系（以40 μL为例）
| 组分 | 单孔体积（μL） | 终浓度 |
| 4× MyqPCR Reaction Buffer （40618-A) | 10 | 1× |
| 待测样本DNA/阳性质控 | 20 | |
| MyPrimer&Probe MIX (40618-B) | 1 | 0.4 μM |
| IC (40618-C) | 1 | |
| 超纯水 | 8 | |
| Total | 40 |
【注】：
1）为保证实验的稳定性，40618-A、40618-B组分需储存于-20℃。
2）为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将40618-C、40618-D分装储存于-80℃。
3）qPCR Mix配制过程不加待测样本DNA与阳性质控。
三、加样
1）充分震荡混匀qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
2）向每孔反应管中分装20μL qPCR Mix。
3）向已分装过qPCR Mix的反应管中加入样品，示例如下：
表2. 加样示例
| 待测样本DNA | 20 μL qPCR Mix+20 μL 待测样本DNA |
| NTC对照 | 20 μL qPCR Mix+20 μL DNA Elution Buffer （或者ddH2O） |
| 阳性质控（PC） | 20 μL qPCR Mix +20 μL 阳性质控 |
【注】：此时每个反应孔的体积为40μL
4）盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
5）反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底；充分震荡混匀后，再短时低速离心，将管盖和管壁的残留液体收集至底，如有气泡，需将气泡排尽。
qPCR程序参数设置
1、创建目的通道探针：
创建目的通道的FAM探针，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为none；
创建IC 通道的VIC探针，选择报告荧光基团为VIC，猝灭荧光基团为none；
选择检测参比荧光为ROX（可选择，试剂盒中不含）。
2、标准扩增程序：
| 反应阶段 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
| 1 | 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 |
| 2 | 扩增反应 | 95℃ | 15 sec | 45 |
| 62℃* | 30 sec |
【注】：* 荧光信号采集。
结果分析
1、PC、NTC结果判断:
| 质控样本 | FAM 信号 | VIC 信号 |
| PC | Ct<40 ,且有明显的扩增曲线。 | Ct<40 ,且有明显的扩增曲线。 |
| NTC | Ct≧40 ,或无明显的起峰 | Ct≧40 ,或无明显的起峰 |
2、待测样本检测结果判定：
| FAM 信号 | VIC 信号 | 结果判断 |
| Ct<40 ,且有明显的扩增曲线 | Ct<40 ,且有明显的扩增曲线 | 阳性 |
| Ct≧40 ,或无明显的起峰 | 有抑制 | |
| Ct≧40 ,或无明显的起峰 | Ct<40 ,且有明显的扩增曲线 | 阴性 |
| Ct≧40 ,或无明显的起峰 | 有抑制 |
【注】：*VIC信号如果有抑制，需重测或对样本进行合适处理消除抑制因子
HB210901
