Language
产品信息：
| 货号 | 试剂盒组分* | 包装 | 保存 |
| GB4500-050 | 细胞Lysis Buffer A | 5 ml | -20℃ |
| 细胞Lysis Buffer B | 0.5 ml | -20℃ | |
| 2x PCR Premix | 0.65 ml | -20℃ | |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.1 ml | -20℃ | |
| GB4500-100 | 细胞Lysis Buffer A | 10 ml | -20℃ |
| 细胞Lysis Buffer B | 1 ml | -20℃ | |
| 2x PCR Premix | 1.3 ml | -20℃ | |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.2 ml | -20℃ | |
| GB4500-200 | 细胞Lysis Buffer A | 20 ml | -20℃ |
| 细胞Lysis Buffer B | 2 ml | -20℃ | |
| 2x PCR Premix | 2.6 ml | -20℃ | |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.4 ml | -20℃ | |
* 试剂用量是以接种在96孔板内的贴壁细胞数为基准。
存储条件：保存于-20℃，有效期6个月，应避免反复冻融。
(一) 实验步骤
如需同时处理大量样本, 可先将细胞Lysis Buffer A 和 Lysis Buffer B 按 10:1 的比例混合，涡旋均匀，然后将100 μl混合后的细胞Lysis Buffer AB分别加到培养皿各孔中。
A. 96孔板贴壁细胞裂解液的制备：
1. 实验前向96孔板中接种1--2x 10^4 细胞。根据实验要求将细胞培养适当时间，确保细胞没有过度生长或处于休止期。
2. 实验时用枪头尽量吸尽培养皿中的培养基。
3. 向培养皿各孔中分别添加200 μl的PBS Buffer （自备），轻轻摇匀, 再用枪头尽量吸尽PBS。
4. 向各孔中添加50 μl 混合后的细胞Lysis Buffer AB，37℃放置5分钟。
5. 用枪头将各孔的细胞 Lysis Buffer AB上下吸取5次, 使细胞和试剂混匀，然后将液体转移至离心管中，90℃水浴10分钟。
6. 使用上述操作得到的细胞裂解产物即可作为PCR反应的模板。
B. 悬浮细胞裂解液的制备：
1. 实验的当天将含有1--2x 10^4细胞的培养液转移到适当容量的离心管中。
2. 1000x rpm，离心5分钟。用P-200移液枪头在不接触到细胞沉淀的前提下尽可能地移走全部上层培养基。
3. 向离心管中添加200 μl的PBS Buffer，不必震荡混匀。
4. 1000x rpm，离心2分钟。用枪头尽量吸尽PBS。
5. 向各孔中添加50 μl混合后的细胞Lysis Buffer AB，快速震荡混匀或用移液枪头上下吸取5次使样本和试剂混匀。
6. 37℃放置5分钟，然后90℃水浴10分钟。
7. 使用上述操作得到的细胞裂解产物即可作为PCR反应的模板。
(二) 实验设置
表一: 贴壁细胞接种量和各试剂的单孔使用量
| 培养皿 | 贴壁细胞 接种密度 | PBS Buffer用量 (μl) | GBdirect 细胞Lysis Buffer AB用量 (μl) |
| 96-孔板 | 1 - 2x10^4 | 200 | 50 |
| 48-孔板 | 2 – 5x10^4 | 400 | 100 |
| 24-孔板 | 0.6 - 1.3x10^5 | 800 | 200 |
| 12-孔板 | 1.3 – 2.6x10^5 | 1000 | 400 |
| 6-孔板 | 3 - 6x10^5 | 2000 | 1000 |
表二. PCR反应设置：
| PCR反应成分 | 25μl体系 |
| DNA 模板（μl） | 1-3 |
| 2X PCR Premix（μl） | 12.5 |
| HiFi DNA聚合酶（μl） | 0.25 |
| Forward & Reverse Primers (10 μM)（μl） | 0.25 |
| ddH2O | to 25 μl |
表三. PCR循环设定（推荐）：
| 温度 | 94℃ | 94℃ | 55-58℃ | 72℃ | 72℃ |
| 时间 | 5 分钟 | 30 秒 | 30 秒 | 1分钟/1kb | 5 分钟 |
| 循环 | 1次 | 35次 | 1次 | ||
实验结果分析：
1. 若直接使用未稀释的DNA模板进行PCR反应，发现没有PCR产物或PCR条带出现弥散等现象，建议首先调整DNA 模板用量。例如，使用ddH2O 或TE Buffer（自备）对裂解得到的DNA 模板进行稀释，比例可为1：1或1：2（DNA 模板：稀释液），然后在25 μl PCR体系中分别加入 1 μl、2 μl、3 μl稀释后的DNA模板作为优化条件。
2. 设立阳性及阴性对照反应以发现问题所在。阳性反应可用50ng纯化的细胞DNA为模板，阴性反应以ddH2O为模板，引物可采用以前成功扩增的引物。
