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产品概述
支原体检测试剂盒由普诺赛技术团队精心优化，经过长期测试，可用于检测细胞培养基、血清和细胞培养液等生物制品中的常见支原体，包括精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、肺支原体（M.pulmonis）、牛支原体（M. bovis）和酵母菌支原体（M. yeatsii）等。针对常见支原体保守序列设计特异性引物，可以直接使用细胞培养液作为检测模板，特异性扩增支原体DNA。本产品操作简单、特异性强、灵敏度高。
试剂盒组成
| Component | Volume (50Tests) | Volume (100Tests) |
| Taq PCR Master Mix (With Dye), 2 × | 0.5 mL | 1 mL |
| Primer Mix (10 μM) | 40 μL | 80 μL |
| Positive Control | 40 μL | 80 μL |
| MycoFree H2O | 1 mL | 1 mL |
操作步骤
注意：PCR反应体系的液体配置过程请在无菌无支原体环境操作，如超净台或者生物安全柜，需严格无菌操作，避免外源污染造成结果假阳性。
1. 细胞培养48-72 h，建议待细胞密度生长至80%以上时，取10 μL细胞培养液做PCR模板备用。（悬浮细胞1500 rpm离心3 min，再取上清液）。
2. 在PCR专属区域参照下表配置PCR反应体系，需设置阴性对照（MycoFree H2O）与阳性对照（Positive Control）组。
PCR反应体系配置建议：
| Component | Test Sample | Positive Control | Negative Control |
| Taq PCR Master Mix (With Dye), 2 × | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| Sample | Test Sample 2 μL | Positive Control 2 μL | / |
| Primer Mix (10 μM) | 0.8 μL | 0.8 μL | 0.8 μL |
| MycoFree H2O | 7.2 μL | 7.2 μL | 9.2 μL |
3. 轻柔混匀体系，按照下表所示设置PCR反应程序：
| Step | Temperature | Duration | Cycles |
| 1 | 94℃ | 3 min | 1 |
| 2 | 94℃ | 15 s | 35-40* |
| 3 | 56℃ | 15 s | |
| 4 | 72℃ | 15 s | |
| 5 | 72℃ | 1 min | 1 |
| 6 | 4℃ | - | - |
* 一般推荐的循环数为35，若需复测获得更明亮的条带才使用40循环。
4. PCR结束后应尽快检测，如无法立即检测，可将PCR产物保存在4℃待用，不要存放超过一周。
5. 凝胶电泳：取10 μL产物，1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳（推荐160 V，15 min），用凝胶影像分析仪拍照并保存结果。
6. 通过与阳性对照组和阴性对照组结果比较，判断样品支原体是否存在污染情况。阳性条带大小约250 bp，随种属差异略有浮动。
四、注意事项
1. 确保所有试剂在使用前彻底解冻（4℃冰箱放置2 h或常温放置0.5 h）。解冻后请将所有组分离心（推荐1000 rpm，30 s）后混匀（尤其是液体量较少的组分，离心收集管壁液体），再使用。
2. PCR体系配置完成后应尽快放入PCR仪反应，或暂存于4℃冰箱保存（6 h以内）。产品现配现用，不建议配置好的反应体系过夜放置。
3. 试剂应尽量避免反复冻融。产品若在4℃存放，请在3个月内使用完毕。长期不使用请于-5~-20℃冻存。
4. 待检测样本取样后应48 h内尽快检测，若无法立即检测，请低温（-5~-20℃）保存并在一月内检测完毕。
5. 操作时请佩戴口罩，避免口腔中可能携带的支原体污染样本造成假阳性结果。
6. 针对条带较弱的样本或其他存疑情况，可将样本进行10倍浓缩后复检确认。浓缩操作：12000 rpm离心3 min，去上清；加入原液1/10体积的无支原体纯水（自备）再次混匀即可。
7. 所有产品请于保质期内使用，超出保质期，必须放弃使用。
