BeyoDirect™支原体qPCR检测试剂盒

碧云天生产的BeyoDirect™支原体qPCR检测试剂盒(BeyoDirect™ Mycoplasma qPCR Detection Kit)，是一种无须提取样品中DNA或RNA，可以直接使用细胞培养液或血清等样品，通过探针法qPCR (Quantitative PCR)高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染的试剂盒。本试剂盒可快速、有效、高灵敏地检测支原体污染。

支原体(Mycoplasma)是最小、最简单的原核生物。支原体有如下特征：支原体无细胞壁结构，所以针对细胞壁的许多常见的抗生素，如青霉素或β-内酰胺类抗生素对支原体无效；支原体大小介于细菌和病毒之间，约为0.2-0.8μm，所以部分支原体可通过0.22μm滤器，常规的过滤对支原体无效；很多支原体由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供营养，所以通常吸附或散落在细胞表面和细胞之间。支原体的这些特征使细胞培养过程中存在支原体污染的风险，细胞的支原体污染已经成为一个世界性的普遍问题[1]。

支原体污染可能会严重影响细胞的状态，使细胞的基因表达、代谢特征发生变化，导致细胞生长减缓、分化和死亡异常，严重影响细胞功能。这些影响因素会严重影响实验结果的可靠性、可重复性和一致性，因此支原体污染的检测非常重要。

细胞培养过程中的细菌、酵母或霉菌污染在光学显微镜下可见，但支原体污染在光学显微镜下通常不可见，必须通过特定的检测方法进行检测。检测支原体污染的常用方法有支原体分离培养、ELISA、发光法等特殊的生化检测以及DNA荧光染色检测等。上述检测方法中，大多操作步骤相对比较烦琐、灵敏性不高或所需时间较长。而qPCR法操作方便简单，PCR扩增后无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。

本试剂盒根据支原体基因组中保守的23S rRNA操纵子编码区序列[2]，设计特异性引物和荧光探针(FAM标记)，可直接以细胞培养液上清或血清等生物材料为模板进行检测。本试剂盒可以扩增和检测39种支原体。本试剂盒特异性扩增支原体DNA，对细菌、真菌、真核细胞DNA不扩增。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、稳定剂、Nuclease-free Water和镁离子等所有的通用组分。本试剂盒还包含Internal Control DNA (VIC标记)，即内对照DNA，用于添加到每个PCR反应中，检测是否有抑制PCR反应物质。此外，本试剂盒提供Positive Control，即阳性对照，可用于检测试剂盒本身是否能正常工作。

图1. 碧云天支原体qPCR检测试剂盒(C0303)用于阳性对照和阴性对照的检测效果图。左图是试剂盒中的阳性对照，右图是试剂盒中的Nuclease-free water作为阴性对照，两组对照同时添加了内参对照DNA，FAM为支原体检测信号，VIC为内参对照检测信号。左图的支原体和内对照检测曲线正常，而右图仅内参对照检测曲线正常，支原体为阴性。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒适用于具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪，如ABI的7500、7900、StepOne、QuantStudio系列，Roche的LightCycler480、SmartCycler，Bio-Rad的CFX96、Chromo4、Opticon 2、iCycler IQ、iQ5，Qiagen的Rotor Gene 6000，上海宏石SLAN-96P等。

本试剂盒进行了相关优化，可直接检测含支原体的细胞培养液上清、血清等样品，无须单独提取DNA。本试剂盒所用检测方法非常灵敏，通过阳性对照计算出的检测下限约为2-20 copies/μl。

如果发现有支原体污染，优先建议更换无污染的细胞进行培养。如果有必要预防或去除支原体，可使用专用的支原体预防或去除试剂，如支原体清除试剂(C0288)、支原体清除试剂Plus (C0290)、支原体预防去除试剂I (C0292)、支原体预防去除试剂II (C0293)、Myco-Zero™支原体去除试剂(C0280)、Myco-Zero™ Plus支原体去除试剂(C0285)。

本产品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行100次和200次检测，中包装分别可进行500次和1000次检测。

-20℃保存，一年有效。其中BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)和Primer Probe Mix需要-20℃避光保存。尽量避免反复冻融。

使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)和Primer Probe Mix中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。请勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

本试剂盒可以检测出细胞污染的常见支原体种类，对于少数怀疑可能有不能鉴定的支原体种类污染的比较重要的细胞，推荐使用碧云天Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒(C0297/C0298)进行双重检测。严格的支原体检测，需使用两种以上不同原理的方法同时检测，才能最有效的避免假阳性和假阴性。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。