DNA pull-down Kit for Animals

实验原理

DNA pull down技术是体外研究DNA与蛋白质互作的有力工具。该技术针对目标区域  设计特异性DNA 探针并经过脱硫生物素标记，脱硫生物素探针可以和偶联在磁珠上的  链霉亲和素亲和结合(Wang,Yu  et  al.2004)。然后，细胞提取物与磁珠-DNA 探针孵育， 作用蛋白质分子可以和DNA 探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去  除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA 探针-蛋白质复合物，再经过Western  Blot或质  谱(MS) 鉴定蛋白质类型。其原理图如1.1:

 

 

实验流程

 

试剂盒组分、操作步骤等更多细节请查看zuixinban版说明书

常见问题与解析

Q1:通过pull-down 后银染验证发现，没有想要的目的条带?

1)有可能是样品被蛋白酶降解，对应的策略是需要添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持 4℃以下冰上操作并防止冻融；

2)有可能是加入生物素标记DNA 量不足，可以增加生物 素标记DNA 量；

3)裂解液盐碱度太高，需用低盐碱度的裂解液；

4)加入细胞裂解液不 够，可以增加细胞裂解量。


Q2：如何提高DNA pull down实验的准确性和可靠性？
解析：提高DNA pull down实验的准确性和可靠性可以从多个方面入手。首先，优化DNA探针的设计和合成，确保其能够特异性地结合目标蛋白。其次，选择合适的磁珠和孵育条件，以提高蛋白与DNA探针的结合效率。此外，严格控制实验操作，避免污染和误差，也是提高实验准确性的关键。最后，结合后续的质谱检测等技术手段，对捕获的蛋白进行精确鉴定和分析，可以进一步提高实验的可靠性。
 

Q3：DNA pull down实验的原理是什么？
解析：DNA pull down实验的原理是基于体外结合。首先，根据启动子区域设计DNA探针并进行生物素标记，这些标记的探针随后结合到链霉亲和素修饰的磁珠上，形成磁珠-探针复合体。然后，将这个复合体与提取的蛋白孵育，以鉴定与DNA探针有特异性结合的蛋白质。
 

Q4：DNA pull down实验的成功率会受到哪些因素的影响？
解析：DNA pull down实验的成功率受到多种因素的影响。其中，蛋白的表达丰度是一个关键因素，低丰度的蛋白可能难以被捕获。此外，蛋白与DNA结合的强弱程度也会影响实验结果。实验操作中，如DNA探针的设计、磁珠的选择、孵育条件等，也都可能对成功率产生影响。
 

Q5：为什么实验对照组也能鉴定出蛋白？
解析：实验对照组鉴定出蛋白的可能原因有多种。首先，如果物种蛋白数据库完整度低或肽段注释质量差，可能导致非特异性结合。其次，实验过程中使用的试剂或外部环境中的蛋白污染，如人的角蛋白污染，也可能导致对照组出现蛋白信号。
 

Q6：DNA pull down实验中为什么选择双链DNA作为探针？
解析：在DNA pull down实验中，通常选择双链DNA作为探针。这是因为双链DNA能够形成稳定的双螺旋结构，相比于单链DNA或RNA，其结构更为稳定，不易发生自我折叠或形成复杂空间结构，从而提高了与蛋白结合的特异性和稳定性。

技术应用

DNA pull down技术的应用广泛，主要集中在以下几个方面：

1. 转录因子结合位点分析：研究特定转录因子如何识别并结合到DNA上的特定序列，从而调控基因表达。通过设计含有潜在结合位点的DNA探针，进行pull down实验，可以鉴定与这些位点结合的转录因子，深入了解基因调控网络。

2. 染色质相互作用研究：探索DNA与组蛋白修饰、染色质重塑复合体以及其他DNA结合蛋白的相互作用，揭示表观遗传调控机制。

3. 疾病相关蛋白研究：在某些疾病中，特定蛋白质与DNA的异常结合可能导致基因表达异常。通过DNA pull down技术，可以发现这些疾病相关的蛋白质因子，为疾病机理研究和药物靶点筛选提供线索。

4. 基因编辑验证：在CRISPR/Cas9等基因编辑技术中，DNA pull down可以用来验证编辑后是否成功改变了特定蛋白质与DNA的结合模式，评估基因编辑的效果。
    

联合验证方法

为了提高DNA pull down实验结果的可靠性和准确性，常结合以下方法进行验证：

1. 质谱分析与生物信息学：将pull down得到的蛋白质进行质谱分析，鉴定出的蛋白质列表可通过生物信息学工具进一步筛选，寻找功能相关的蛋白质群或已知的DNA结合蛋白，以排除假阳性结果。

2. ChIP-qPCR/ChIP-seq：结合染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）技术，特别是ChIP-qPCR或ChIP-seq，可以验证特定蛋白质是否在活细胞中确实与特定DNA序列结合，提供体内证据。

3. EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）或Shift-Western：这些技术可以直观地观察蛋白质-DNA复合体的形成，通过凝胶电泳观察蛋白质对特定DNA探针的迁移影响，进一步确认DNA pull down的结果。

4. 体外结合实验：通过纯化感兴趣的蛋白质，并在体外条件下与标记的DNA探针进行结合实验，验证两者的直接相互作用，排除细胞内其他因素的干扰。