实验原理

RNA pull-down是研究细胞内RNA与蛋白/RNA结合情况的技术。先将RNA进行标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，从⽽形成RNA-RNA/蛋⽩质复合物， 进而检测与之结合的RNA或蛋⽩质。复合物洗脱后，通过定量PCR（pull down PCR）或⾼通量测序（RNA pull down-seq）方法来鉴定目标RNA是否与某些RNA分子相互作⽤，通过western blot（pull down-WB）实验和质谱（pull down-MS）技术检测目标RNA是否与某些蛋白相互作⽤。

 

实验流程

 

试剂盒组分、操作步骤等更多细节请查看zuixinban说明书

 

常见问题

1.实验全程如何预防RNA降解？

实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。

 

2.RNA pull-down⼀定要体外转录合成RNA探针吗？

体外转录只是获得RNA的⼀种方式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功了,这时我们可以利用设计合成⼀小段目的RNA探针,通过探针与目的RNA结合,再与蛋白结合,便可绕过这个问题。

 

3.RNA在转录出来后，其OD⼀般都不高，可以使用吗？咋定量呢？

OD值不高可进行RNA纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。而定量问题⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也⽤仪器测量RNA的浓度，但通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/μL以上。并且pull-down实验不需要多精确的定量，都会加入过量的探针。

 

4.关于样本处理：细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理？细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理？还是就是裂解细胞就行了？

细胞裂解需要加入蛋白酶和RNA酶抑制剂，最好能够进行超声处理。另外裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。

 

5.lncRNA引物设计有什么注意事项么？或者说与普通的引物设计有什么区别么？

体外转录扩增的引物只需要在正向引物5端加⼊T7启动子序列即可。

 

6.想问下有推荐的银染试剂盒么？

赛默飞或者我们金开瑞的都可以。

 

7.质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？

这个筛选多少分算有效？pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。

 

8.做lncRNA pull down+质谱⼀般会发现多个互作蛋白对吗？

对这多个蛋白，如何选择就哪⼀种继续研究下去？ 不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。

金开瑞-提供核酸和蛋白的整体研究方案：

武汉金开瑞生物工程有限公司是一家专业致力于为全球制药企业、诊断试剂企业、科研试剂研发企业、高校和科研院所以及大型医院提供蛋白及相关研究技术服务的高新技术企业。金开瑞极其注重平台技术提升，现已有多项自主知识产权和软件著作权专利，并已通过ISO9001质量管理体系认证，2018获批“千企万人”支持计划。公司以“细胞外囊泡”研究中心、基础生物医学实验中心、蛋白抗体中心和分子生物学中心为依托，提供核酸和蛋白的整体研究方案，与众多科研单位携手开展了大量的探索项目。截止到目前，已支持客户发表科研论文达1000+篇，累计影响因子6000+。

更多服务内容及优惠活动，详见公司主页