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His标签重组蛋白表达与纯化试剂盒
描述
本试剂盒提供从基因克隆到蛋白表达的全流程解决方案：
1. 线性化pET表达载体（pET11a和pET22b，N-或C-标签可选）；
2. T4连接酶（耐盐耐高温可选）与DH5α感受态（Top10和XL10-GOLD可选）确保高效克隆筛选；
3. Rosetta DE3 pLysS（ER2566和gami系列可选）冷冻感受态优化蛋白表达，兼容稀有密码子。
4. 低温诱导支持可溶性蛋白表达优化。我们提供Protein Refolding Kit帮您解决包涵体问题。
宿主菌
1. DH5α超级化学感受态细胞，最常用于质粒扩增和质粒构建，转化效率高，可用于蓝白斑筛选。
2. TOP10超级化学感受态细胞，生长速度快，转化效率高，常用于构建克隆，可用于蓝白斑筛选
3. XL10-Gold超级化学感受态细胞，转化效率最高的感受态细胞。用于高难度克隆的感受态细胞。有效转化大DNA分子。
4. Rosetta DE3 pLysS感受态细胞（表达用）氯霉素抗性，菌株含有pRARE质粒，补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平；λ噬菌体DE3溶原化衍生菌株，IPTG可以诱导在lacUV5启动子控制噬菌体 T7 RNA聚合酶表达，适合IPTG诱导的T7启动子载体，常用的pET系列载体，同时含有大肠杆菌RNA聚合酶，也可用于非T7启动子表达载体（pGEX，pMAL等）的蛋白表达；pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还可与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，进而降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。
5. Rosetta-gami 2 DE3 pLysS感受态细胞，本菌株含有pRARE2质粒，除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有 的AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和GGA六个稀有密码子的tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA；IPTG可以诱导在lacUV5启动子控制噬菌体 T7 RNA聚合酶表达；适合IPTG诱导的T7启动子载体，常用的pET系列载体；同时含有大肠杆菌RNA聚合酶，也可用于非T7启动子表达载体（pGEX，pMAL等）的蛋白表达；具有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还可与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，进而降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。携带有TrxB和Gor基因突变提高含二硫键正确折叠蛋白的高效表达。
6. ER2566感受态细胞，BL21的K-12部分基因组嵌合菌株；耐受非特异性核酸酶所引起的DNA损伤，常用于表达限制性内切酶、核酸酶以及DNA聚合酶等重组蛋白；Lac调控T7 RNA聚合酶位，适用于IPTG诱导表达系统(如pET系列)；细胞质Lon蛋白酶和和胞外膜上OmpT蛋白酶缺陷，有效减少目的蛋白降解；fhuA2赋予菌株对噬菌体T1的抗性；Δ(mcrC-mrr)114，mcr-73突变取消对甲基化DNA限制。
组分列表
名称 | 规格 | 保存条件 |
线性化pET-6xHis载体（50 ng/μl，酶切位点可选） | 50 μl | -20℃ |
限制性内切酶（2支可选） | 20 μl | -20℃ |
T4 DNA连接酶（含10×缓冲液） | 20 μl | -20℃ |
DH5α化学感受态细胞（10×50 μl，可选） | 10管 | -80℃ |
Rosetta DE3 pLysS感受态细胞（10×50 μl，可选） | 10管 | -80℃ |
Rosetta DE3 pLysS诱导表达阳性对照甘油菌 | 100 μl | -80℃ |
阳性对照质粒（pET-6xHis-EGFP, 20 ng/μl） | 20 μl | -20℃ |
100 mM IPTG（无菌） | 1 ml | -20℃ |
100 mg/mL氨苄青霉素 | 1 ml | -20℃ |
34 mg/mL氯霉素 | 1 ml | -20℃ |
溶菌酶 | 200 mg | -20℃ |
超级核酸酶 | 10 μl | -20℃ |
蛋白酶抑制剂100X | 0.5 ml | -20℃ |
裂解液 | 500 ml | 4℃ |
洗涤液 | 500 ml | 4℃ |
洗脱液 | 500 ml | 4℃ |
His标签纯化凝胶 | 5 ml | 4℃ |
亲和层析柱（12 mlX10 支） | 1 包 | 4℃ |
10×Ni-NTA结合/洗脱缓冲液 | 各1 ml | -20℃ |
操作流程
1. 插入片段制备：
o PCR扩增目产物/基因合成产物/质粒酶切产物。
o 双酶切纯化片段（用户自备纯化试剂盒），为保证连接效率，产物浓度不低于10ng/μl。
2. 连接反应：
解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系。
Component | 20μl reaction |
10X T4 DNA Ligase Buffer | 2μl |
Vector DNA | 0.02pmole |
Insert DNA | 0.06pmole |
T4 DNA Ligase | 1μl |
Nuclease-free water | Up to 20µl |
16℃孵育过夜或室温孵育10分钟。
3. 转化与筛选：
a 取1支DH5α感受态细胞置于冰浴融化。
b 加入5μl连接产物，轻弹混匀，冰浴静置30分钟。
c 42 ℃水浴热激90秒，快速转移至冰浴静置冷却3分钟。
d 加入无抗培养基（SOC或LB，如需要提供可以联系我们），混匀后37 ℃，225rpm摇床振荡培养45分钟。
e 取100μl培养物均匀涂布至对应抗性的琼脂培养板（如需要提供可以联系我们）。37 ℃倒置培养12-16小时。
f 挑取单菌落测序确认目标序列正确。
4. 转化表达感受态
a 取Rosetta(DE3) pLysS感受态细胞置于冰浴融化。
b 加入质粒DNA (1~100 ng），轻弹混匀，冰浴静置30分钟。
c 42 ℃水浴热激45秒，快速转移至冰浴静置冷却3分钟。
d 加入无抗培养基（SOC或LB），混匀后37 ℃，225rpm摇床振荡培养45分钟。
e 取100μl培养物均匀涂布至对应抗性的琼脂培养板。37 ℃倒置培养12-16小时。
f 注意：如果必要可以离心（4000 rpm，3分钟）收集所有菌体，吹打悬浮后涂布平板。
5. 诱导表达
a 挑取3~5个克隆和对照表达菌株分别接入3 ml LB培养基（15 ml离心管），37℃，300rpm培养过夜
b 保种，按1:100接入新LB培养基继续培养至OD600=0.6左右
c 每个克隆（含对照）转入2支1.5ml无菌离心管，1支加入终浓度0.5 mM IPTG，1支作对照，继续培养3小时。
d 取100 μl菌液跑SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析诱导情况。
6. 蛋白纯化
a 按上述培养条件，放大至100 ml菌液诱导表达
b 5000rpm，4℃，5min离心收集菌体，可直接裂解或-80ºC冻存备用。
c 加入12ml非变性裂解液+1*cocktail蛋白酶抑制剂+12mg溶菌酶（≥40,000 units/mg）+0.12μL Benzonase Nuclease（≥250 units/μL），vortex充分重悬菌体，置于4ºC摇床1小时（如无超声或匀浆设备可适当延长裂解时间）。
d 可选：冰浴超声裂解，60%功率，超声10s，间隔10s，处理6次。尽量避免产生泡沫影响破碎效果。
e 4℃，10000g离心30min，取上清加1.2ml混匀的His标签纯化凝胶，于4ºC旋转或摇床摇1小时。取部分沉淀加1XSDS-PAGE上样缓冲液煮沸待用
f 将上述混合物注入6ml空柱管中，在重力作用下使柱内液体流出；然后洗柱8次，每次加入1ml非变性洗涤液*30s；最后洗脱6次，每次加入0.6ml非变性洗脱液*30s。
g 分析表达纯化情况：取部分穿流液，洗涤液和洗脱液，SDS-PAGE电泳分析表达情况。
FAQ
无诱导表达
a 阳性对照没有表达，请严格按照说明书操作重复诱导条件，确保诱导温度，时间和诱导剂浓度；
b 阳性对照有表达，请确认表达载体序列是否正确，氨基酸密码子是否优化，优化诱导条件包括浓度，温度，时间；也可以考虑尝试不同的载体和宿主菌。
表达水平低
表达水平低可以通过优化诱导条件，更换表达载体和宿主菌改善
包涵体
包涵体是重组蛋白表达常见问题，可以通过低温诱导，融合可溶性标签，共表达辅助蛋白，更换宿主菌改善，也可以纯化包涵体蛋白进行重溶解折叠（Protein Refolding Kit，K1001）。
