rProtein A MagPoly Beads

1. 产品介绍rProtein A MagPoly Beads 是 rProtein A 高密度定向包被到超顺磁性聚合物微球表面，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于 90%的抗体。Protein A 是一种分离自Staphylococcus aureus的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物 IgG，但是不与狗 lgG 结合，不结合人 lgM、lgD 和 IgA。蛋白A 与蛋白 G 与不同来源及亚类的免疫球蛋白结合能力不一样，具体见附表。天然 Protein A 有五个 IgG 结合区域和一些未知功能的区域，重组 protein A 去除了与白蛋白及细胞表面结合位点，只含有五个 IgG 结合区域 ，减少了非特异性吸附。 表 1. rProtein A MagPoly Beads 产品性能2. 操作流程本操作流程主要为免疫沉淀反应，每次反应使用 50 μl rProtein A MagPoly Beads 为例，可根据需要适当的增加或减少磁珠使用量。2.1 缓冲液准备所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。平衡/洗杂液：0.15 M NaCl，20 mM Na₂HPO₄，pH 7.0洗脱液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5交联液：0.2 M Tris(2-Hydroxyethyl)Amine，pH 8.2交联剂：DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）终止液：50 mM Tris, pH 7.5                               2.2 样品准备方案I：贴壁细胞的裂解1) 小心去除单层细胞的培养基。2) 用预冷 PBS 清洗细胞两次。3) 根据表 2 的推荐体积中加入预冷裂解缓冲液。冰上孵育 5 min，期间混匀几次。4) 将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约 13000×g 离心 10 min，分离细胞碎片。5) 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。表 2. 针对各种标准培养皿的裂解缓冲液的推荐使用体积方案 II：悬浮培养细胞的裂解1）将细胞悬液以 1000×g 离心 5 min，收集细胞，弃上清。2）用预冷 PBS 将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以 1000×g 离心5 min，收集细胞，弃上清。3） 向细胞团块中加入预冷裂解缓冲液。每 50 mg 细胞团块使用500 μl。4）将上述裂解好的样品在冰上孵育 5 min，期间混匀几次。13000×g 离心 10 min，去除细胞碎片。5）将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。2.3 磁珠准备1) 将 rProtein A MagPoly Beads 颠倒或漩涡混合均匀。2) 取 50 μl rProtein A MagPoly Beads 加入新的离心管中。放置在磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃保护液。3) 将离心管从磁分离器上取下来，加入 200 μl 平衡液，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃保护液。重复洗 2 次。2.4 抗体吸附1) 加入 100 μl 平衡液将磁珠悬浮，加入目标抗体溶液（样品体积根据磁珠载量计算），充分混匀。2) 室温孵育 10min 以上（具体时间根据结合效果调整），可以振荡或漩涡混合均匀。3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清液。如需要可留做进一步检测。4) 加入 500 μl 洗杂液混合均匀，置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清液。重复洗杂至少 3 次。2.5 抗体交联 (备选)1) 如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行操作 2.6。50 μl-1 ml 磁珠量均可以按照以下步骤操作，无需额外增加交联液积。2) 加入 1 ml 交联液，振荡悬浮，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次。3) 再加入 1 ml 含有 20 mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交联液，此试剂需要现用现配。振荡悬浮，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使溶液和磁珠充分接触，约 30 min 后，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。4) 使用 1 ml 终止液悬浮磁珠，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使溶液和磁珠充分接触，约15min 后，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。5) 加入 1 ml 平衡液，颠倒混匀，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。再重复两次。2.6 抗原结合反应1) 加入含有抗原的样品（步骤 2.2，通常 100-1000 μl)，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。2) 在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 10 min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应 1 h 或者在4℃下反应过夜。3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，以备后续检测。4) 向离心管中加入 1 ml 洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，再重复洗涤两次。2.7 抗原洗脱A. 变性洗脱此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。1) 从磁分离器上取下离心管，向其中加入 25 μl 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀，95℃加热 10 min。2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集上清液进行 SDS-PAGE 检测。B. 非变性洗脱1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入 300 μl 洗脱液，混合均匀，室温孵育5 min。2) 置于磁性分离器上 ，进行磁性分离，吸取上清为洗脱液至新的离心管中。3) 重复步骤 1）和 2）两次，收集洗脱液，与 2）中洗脱液混合，加入中和液中和至 pH 7.0-8.0。3. 订购信息及相关产品附表. Protein A、Protein G 和 Protein A/G 对不同抗体的结合能力++++=结合能力强; ++=结合能力中等; —=结合能力弱或没有结合