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Theta Protein Refolding Kit
组分
Buffer 1 | 11 mL | Buffer 10 | 11 mL |
Buffer 2 | 11 Ml | Buffer 11 | 11 mL |
Buffer 3 | 11 mL | Buffer 12 | 11 mL |
Buffer 4 | 11 mL | Buffer 13 | 11 mL |
Buffer 5 | 11 mL | Buffer 14 | 11 mL |
Buffer 6 | 11 mL | Buffer 15 | 11 mL |
Buffer 7 | 11 mL | DTT | 1 mL |
Buffer 8 | 11 mL | Glutathione, reduced | 1 mL |
Buffer 9 | 11 mL | Glutathione, oxidized | 1 mL |
1. 产品概述
· 用途：用于从大肠杆菌表达的包涵体中复性重组蛋白，通过筛选15种不同缓冲液条件，快速确定最佳复性参数。
· 优势：采用部分因子实验设计（fractional factorial matrix），简化条件优化流程，节省时间和资源。
· 适用对象：需从包涵体回收活性蛋白的研究人员，适用于实验室规模到中试生产。
2. 原理
· 蛋白质复性：包涵体中蛋白质因折叠中间体聚集而失活，复性需克服聚集并促进正确折叠。
· 关键影响因素：
o 离子强度、pH、温度、氧化还原状态、去垢剂（如Triton X-100）、辅助因子（如精氨酸、蔗糖）及分子伴侣（如谷胱甘肽）。
o 不同缓冲液组合通过调整上述参数，抑制非特异性聚集并促进折叠途径。
· 实验设计：15种缓冲液覆盖13个关键变量（如pH、盐浓度、去垢剂、氧化还原系统），通过统计学分析筛选主要影响因素。
3. 试剂盒组件
· 缓冲液（1-15）：各11 mL，含不同pH（6.0或8.5）、离子强度、辅助因子（如精氨酸、蔗糖）、去垢剂（Triton X-100、PEG 3350）及变性剂（盐酸胍）。
· 氧化还原系统：
o DTT（用于还原环境）：添加到缓冲液1,3,5,7,9,11,13,15。
- GSH/GS-SH（氧化还原对）：添加到缓冲液2,4,6,8,10,12,14，模拟细胞内氧化还原环境。
· 储存条件：DTT溶液4°C保存，GSH/GS-SH溶液-20°C保存。
4. 实验流程
1) 任务1：基础缓冲液筛选
a 包涵体处理：
o 纯化包涵体并溶解于8M尿素（含DTT）。
o 调整蛋白浓度至1 mg/mL。
b 复性反应：
o 向15管缓冲液（每管950 μL）中缓慢加入50 μL变性蛋白，轻柔混匀。
o 4°C或22°C孵育1小时，离心分离可溶性与沉淀部分。
c 结果评估：
o 功能活性检测：直接测定蛋白活性（推荐）。
o 免疫印迹/SDS-PAGE：分析可溶部分中目标蛋白含量。
o 体积排阻色谱（SEC）：区分正确折叠与聚集蛋白。
d 数据分析：
o 构建表格对比各缓冲液条件的影响因子（pH、盐、去垢剂等）。
o 计算各因子的“相对效应值”（Relative Effect），确定关键参数。
2) 任务2：缓冲液优化
a 条件优化：
o 根据筛选结果，调整关键因素（如pH梯度、盐浓度范围）进行多水平测试。
o 评估高浓度蛋白（>1 mg/mL）下的复性效率。
b 规模化复性：
o 稀释法：适用于小规模（1-20 mg），需后续浓缩。
o 透析/超滤：适用于大规模（>20 mg），逐步去除变性剂。
o 示例：动态透析法（48小时梯度置换缓冲液）。
5. 补充方案
1) 包涵体纯化
步骤：
o 破碎细胞后离心收集包涵体。
o 用含4M尿素、去垢剂的洗涤液去除杂质。
o 溶解于6M盐酸胍或8M尿素（含DTT）。
o 关键点：优化洗涤条件（尿素浓度、去垢剂）以提高纯度。
2) 提高可溶性蛋白产量
o 培养基优化：测试不同培养基（如Turbo Broth™）对蛋白可溶性的影响。
o 分子伴侣共表达：诱导GroEL/GroES等伴侣蛋白，促进正确折叠。
6. 注意事项
n 储存与稳定性：GSH/GS-SH需分装避光保存，避免反复冻融。
n 实验验证：复性效率需通过功能活性验证，避免仅依赖SDS-PAGE结果。
n 规模化挑战：高浓度复性需防止聚集，建议结合透析与梯度稀释。
7. 应用与限制
n 适用场景：重组蛋白药物开发、酶学研究、抗体生产。
n 局限性：无法保证所有蛋白成功复性；需结合后续纯化步骤去除杂质。
总结：Theta试剂盒通过系统筛选与优化，为包涵体蛋白复性提供高效解决方案，平衡了实验效率与结果可靠性。用户需结合具体蛋白特性调整条件，并优先通过功能活性验证复性效果。
