Language
碧云天生产的Rapid PNGase F去糖基化试剂盒(变性法)，即Rapid PNGase F Deglycosylation Kit (Denaturing Method)，是一种高效快速去糖基化试剂盒。与PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除N-糖基化修饰需要几小时甚至过夜相比，本试剂盒仅需50ºC孵育10分钟即可完成对糖蛋白N-聚糖链的去除，可有效缩短样品处理时间，处理后的样品可用于SDS-PAGE、Western、高效液相色谱(HPLC)或质谱分析(Mass spectrometry)等。本试剂盒也可以间接用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的糖基化水平检测。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能[1-3]。最 新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
抗体药物的生产中调节和控制糖基化修饰对抗体的活性、药代动力学和免疫原性都有着重要影响。例如在IgG的Fc部分Asn297处有一个保守的N-聚糖链，很多抗体还有额外的N-聚糖链，这些N-聚糖链可能对抗体的活性、半衰期和免疫反应至关重要；而且细胞培养过程中的变量，可能进一步增加抗体糖基化修饰的多样性，因此N-聚糖链的表征和质量控制是抗体药物的关键质量属性(Critical quality attributes, CQAs)之一[4]。
Rapid PNGase F与PNGase F功能相同，通过E.coli重组表达，可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖(Hybrid and complex oligosaccharides)的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc, N-acetylglucosamine)和天冬酰胺(Asparagine, Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖(N-linked oligosaccharides)，将蛋白和糖链修饰分开(图1) [5]。本试剂盒提供的Rapid PNGase F的N端带有His-tag，反应后通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1.碧云天Rapid PNGase F去糖基化试剂盒(变性法) (P2541)移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(Pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被Rapid PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
本试剂盒去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果如图2所示。
图2.Rapid PNGase F去糖基化试剂盒(变性法) (P2541)去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果图。IgG蛋白经过变性处理后内部二硫键全部破坏，抗体重链(Heavy chain, HC)和轻链(Light chain, LC)发生分离。图中为抗体重链部分的电泳条带。C (Control)为未处理的对照。RP1为使用Rapid PNGase F一步法反应，RP2为两步法反应。在20μl反应体系中，10µg不同种属的IgG分别加入1µl Rapid PNGase F，50ºC孵育10分钟。Std (Standard denaturing reaction with SDS)为10µg不同种属的IgG加入1µl PNGase F (P2318)，37ºC孵育4小时的结果。经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Hepes, 4-15%, 15孔) (P0520)电泳，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择碧云天Rapid PNGase F去糖基化试剂盒(变性法) (P2541)和Rapid PNGase F去糖基化试剂盒(非变性法) (P2543)。
Rapid PNGase F储存液：20mM Tris (pH7.4), 50mM NaCl, 5mM EDTA。
本试剂盒用于移除糖蛋白或糖肽的N-糖苷酶切反应时，如果按照每次使用1μl Rapid PNGase F在50ºC反应10分钟，本产品小、中、大包装分别可以用于25、100和500次反应。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2541S-1 | Rapid PNGase F | 25μl |
| P2541S-2 | Denaturing Reaction Buffer (5X) | 100μl |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2541M-1 | Rapid PNGase F | 100μl |
| P2541M-2 | Denaturing Reaction Buffer (5X) | 400μl |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2541L-1 | Rapid PNGase F | 500μl |
| P2541L-2 | Denaturing Reaction Buffer (5X) | 2ml |
| — | 说明书 | 1份 |
-20ºC保存，一年有效。
注意事项：Rapid PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
避免使用含有SDS的缓冲液，SDS会抑制Rapid PNGase F的酶活性。
Tween、Triton X-100、NP-40、辛基葡萄糖苷(Octyl glucoside)、非去垢剂磺基甜菜碱(Non-detergent sulfobetaine)，以及有机溶剂都会抑制Rapid PNGase F的酶活性。
超纯水推荐选购BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
