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产品介绍
重组肽N-糖苷酶F（PNGase F, Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl) asparigineamidase）是一种酰胺水解酶，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌，能够在温和的条件下从糖肽、糖蛋白上面完整切下N-连接的寡糖链（N-Glycan），将寡糖链和蛋白部分分开。
Rapid PNGase F Kit能够在几分钟内完成抗体、融合蛋白以及其他糖蛋白的快速去糖基化，并可用于下游色谱或质谱分析，实现在不影响灵敏度或重复性的情况下缩短酶切时间。
检测原理
PNGase F作为一类重要的糖基化研究工具酶，具有广泛的底物专一性，能够将绝大多数N-糖链（除含α-1,3连接的核心岩藻糖）完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，在蛋白质N-糖基化位点、结构分析以及及功能关系等研究中发挥了重要作用。PNGase F的酶切位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。
产品信息
产品名称 | 货号 | 规格 |
Rapid PNGase F(Glycerol-free) | PR2002-Rapid-01 | 15,000 U/30 μL |
5×Rapid PNGase F Buffer | PR2002-Rapid-02 | 100 μL |
说明：Rapid PNGase F储存缓冲液的组成为50 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5, 25°C)，5 mM EDTA，不含甘油，可兼容液相色谱和质谱分析。
储存条件
PNGase F采用2-8℃低温运输，收到产品后请立即将酶置于2-8℃，严禁冻存；
Rapid Buffer置于-20℃储存。
酶活定义
1个酶活力单位定义：在10 μL反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1 hr内催化释放10 μg变性RNase B＞95% N-连寡糖所需要的酶量。
质量评估
SDS-PAGE纯度≥95.0%；没有检测到污染的外切糖苷酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。本产品已通过底物稳定性试验、残留定性试验、精密度试验、准确度试验、专属性试验、检测限、定量、线性和批次间稳定性试验。
实验步骤
一、一步酶切反应
1. 取10-100 µg糖蛋白溶液，加入5×Rapid PNGase F Buffer和超纯水，使得最终的反应体系为1×Rapid PNGase F Buffer；（例：浓度为20 mg/mL的抗体蛋白：移取5 µL蛋白、4 µL 5×Rapid PNGase F Buffer和11 µL超纯水。）
2. 向上述反应体系终加入1-2 µL Rapid PNGase F；
3. 50℃孵育5 min。
二、两步酶切反应
对于一些糖基化程度较高的抗体或融合蛋白（如FSH，follicle-stimulating hormone，卵泡刺激素），需要增加预热步骤，使蛋白完全变性后，才能有效地去糖基化。
1. 取10-100 µg糖蛋白溶液，加入5×Rapid PNGase F Buffer和超纯水，使得最终的反应体系为1×Rapid PNGase F Buffer；（例：浓度为20 mg/mL的抗体蛋白：移取5 µL蛋白、4 µL 5×Rapid PNGase F Buffer和11 µL超纯水。）
2. 80℃孵育3 min，室温下冷却1 min；
3. 向上述反应体系终加入1-2 µL Rapid PNGase F；
4. 50℃孵育5 min。
三、样品分析
1. 评估糖蛋白糖基化程度及去糖基化程度最简单的方法是SDS-PAGE，去糖基化产物在凝胶上的迁移速度比糖基化底物快；
2. 快速反应产物经回收处理，可以使用蛋白酶等处理、浓缩和纯化后用于下游质谱分析。
数据展示
功能性测试图谱：
图1. 抗体蛋白快速酶切效果图_CE-SDS
图2. 抗体蛋白快速酶切效果图_Labchip
图3. FSH融合蛋白快速酶切效果图_Labchip
FAQ常见问答
问题 | 解决方案 |
PNGase F去糖基化后得到什么产物？ | PNGase F进行糖蛋白去糖基化后，会释放出完整的寡糖链，并在释放糖链的同时将氨基酸特征序列上的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基。 |
PNGase F 在含有尿素的反应体系中是否可以正常使用? | PNGase F在37℃条件下，在2.5 M尿素溶液中可以稳定24 hr，在5 M尿素溶液中可以保留40％的活性。因此反应体系中存在较低浓度的尿素可能不影响PNGase F去糖基化的活性。 |
对于天然糖蛋白的去糖，应该用多少PNGase F去除糖蛋白上的寡糖链？ | 当糖蛋白不用变性时，由于空间位阻效应（二级和三级蛋白质结构），PNGase F相对难到达寡糖链的切割位点。建议更多的酶量和延长反应时间来提高酶去除寡糖链的效率，由于每种糖蛋白都有其特异性，必须根据实验或者经验确定合适的条件。 |
为什么蛋白被降解了？是否可以在 PNGase F去糖基化反应体系中加入蛋白酶抑制剂？ | 蛋白酶会干扰去糖基化实验的结果，当蛋白质处于变性状态时，它更容易被蛋白酶切割。加入适量蛋白酶抑制剂到脱糖基化反应体系中，有助于防止蛋白降解。 |
PNGase F可以与下游分析如HPLC和质谱兼容吗？ | PNGase F有两款产品，PNGase F (Glycerol-free)及PNGase F。两款产品具有相同的活性，特异性及浓度。两者之间的唯一区别是在其储存缓冲液中有无甘油。 由于甘油以及糖蛋白变性缓冲液与HPLC和/或质谱不能兼容，且难以从反应体系中除去，因此如果使用HPLC或质谱进行寡糖链或蛋白分析，建议使用无甘油的酶，同时在非变性条件下进行去糖基化反应。非变性条件下通常需要更多的酶及更长的反应时间。 |
表面活性剂是否会抑制PNGase F酶活性? | 离子及非离子型表面活性剂在0.5%-1.0%浓度范围时，大多数糖苷酶都不受或受到较小影响。但SDS会抑制PNGase F酶的活性，可在反应体系中加入适量的NP-40或Triton X-100抵消其抑制作用。 |
本试剂盒仅用于科研使用，不可用于诊断或治疗应用。
