YJ104 His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶

His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶
Ni-Agarose Resin
本产品 4℃运输；保存于 4℃，禁止产品冻结，长期存放请保证试剂管竖立向上，保质期 24 个月。

货号规格
goodYJ104     1 mL×10

产品简介
good本产品可以用于纯化各种表达系统融合表达的 His 重组蛋白，其是以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联三配位的亚氨基二乙酸 (IDA)，并螯合镍离子 (Ni²⁺)，形成比较稳定的平面四边形结构，从而有更多的位点与 His 标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果。

产品参数
 

自备试剂
 

goodgood注：所用去离子水和缓冲液在使用前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，减少杂质，以提高蛋白纯化效率和防止堵塞纯化柱。

操作步骤
good◆ 样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
good◆gg1. 离心收集大肠杆菌(4℃，4,000×g，30 min)，弃上清；
good◆gg2. 用冷平衡缓冲液重悬细胞，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)；
good◆gg2. 注：所用试剂中不能含有 EDTA、EGTA 等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。
good◆gg3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全；
good◆gg4. (可选)如果裂解物太过粘稠，可以加入RNase A(终浓度10 μg/mL)和DNase I(终浓度5 μg/mL)并在冰上孵育10~15 min；
good◆gg5. 离心收集上清(4℃，12,000×g，20 min)；
good◆gg6. SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性；

good◆ 纯化重组His融合蛋白
good◆gg7. 轻轻重悬 His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶 ，吸取适量加入重力柱中，用5~10倍柱体积的冷 平衡缓冲液 平衡His琼脂糖凝胶；
good◆gg8. 将步骤5制备好的含有His融合蛋白的上清液加入到纯化柱中，流速控制为0.5~1 mL/min；
good◆gg9. 蛋白上清液全部流出纯化柱后，立刻加入 漂洗缓冲液 清洗纯化柱，所需量大约为柱体积的 10~20倍或者直到流出液的A280值达到最低且稳定；
good◆g10. 用5~10倍柱体积的现配 洗脱缓冲液 以0.5~1 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液。或者根据流出液A280值判断，当数值陡然上升时开始接收洗脱液，直到A280数值降至最低且稳定时，停止收集。后续可根据目的蛋白的性质和用途，4℃透析到20 mM Tris-HCl，pH 8.0或者1×PBS，pH 7.4中。

good◆ 凝胶再生及储存
good◆ His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶 可以重复使用，但随着使用次数增多，非特异性结合的蛋白聚集往往会造成流速和蛋白结合载量的下降，此时便需要对琼脂糖凝胶填料进行清洗。
good◆g11. 使用5倍纯化柱体积去离子水清洗琼脂糖凝胶填料；
good◆g12. 使用5倍柱体积100 mM EDTA(pH 8.0)剥落镍离子；
good◆g13. 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
good◆g14. 使用5倍柱体积0.5 M NaOH清洗填料；
good◆g15. 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
good◆g16. 使用3~5倍柱体积100 mM NiSO₄再生挂镍；
good◆g17. 使用10倍柱体积去离子水清洗，即完成琼脂糖凝胶填料再生。
good◆g10. 注：填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中，置于4℃保存。

注意事项
good1. 琼脂糖凝胶应保存在储存溶液中，防止干燥；
good2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good3. 本产品仅限科研使用。

常见问题解析