结直肠癌肿瘤类器官培养试剂盒

OrganoPro™结直肠癌类器官培养试剂盒使用说明

1.产品信息 下面列出的所有组分均是试剂盒组成的一部分(Catalog # K2O-M-CO) ，不单独出售。
 

产品名称	规格	储存温度	保质期
OrganoPro™结直肠癌类器官培养基（Cat# K2O-M-CO）
OrganoPro ™ 结直肠癌类器官培养基	100ml*2	2-8℃	6 个月
OrganoPro ™ 结直肠癌类器官培养基添加剂CO	1ml*2	2-8℃	6 个月
类器官传代酶解液A (Catalog # K2O-TPCSA)
类器官传代酶解液A	10ml*2	2-8℃	6 个月
类器官冻存液 (Catalog # K2O-TPFM)
类器官冻存液	10ml	2-8℃	6 个月

2.未包含在试剂盒内的其他通用试剂或耗材产品
 

产品名称	建议供应商	货号
D-PBS(不含 Ca2+和 Mg2+)	Thermo Fisher	10010031
Corning MatrigelTM 基 底 膜 基质，GFR，低生长因子	Corning/BD	356230
0.4 台盼蓝溶液	Thermo Fisher	15250061
Costar® 24 孔平底组织培养板	Corning	38017
Costar® 24 孔超低吸附微孔板	Corning	3473
Corning® 96 孔圆底超低吸附孔 板	Corning	7007
超低吸附悬浮培养 6 孔板	Corning	27145
AxygenTM 200μl 大口径通用枪 头	Thermo	14-222-730
内旋盖冻存管	Thermo	374511
Falcon®50ml 离心管	Corning	38010
Falcon® 移液管，5ml 和 10ml	Corning	38003 38004

3.实验仪器

1. 细胞培养箱 (37℃，5 CO2)
2. 超净工作台（生物安全 II 级）
3. 篮式转子台式离心机
4. 水浴锅 (37℃)
5. 冰盒和碎冰
6. 实验室冷藏柜
7. 巴氏管和移液器
8. 真空泵

4.类器官建模实验流程图



5.方法与步骤
  5.1 结直肠癌类器官完整培养基配制 在无菌条件下制备OrganoPro^TM结直肠癌类器官生长完全培养基。请参阅产品信息中的储存条件对试剂盒进行储存，以确保试剂稳定性。配置前根据使用说明准备好所需材料。
在无菌条件下，往100ml OrganoPro^TM结直肠癌类器官培养基中，加入1ml OrganoPro^TM结直肠癌类器官培养基添加剂 CO，制备成结直肠癌类器官完全培养基。配置好的完全培养基，存放在 4℃，使用前将此完全培养基孵育至室温后使用。 注意：OrganoPro^TM肿瘤类器官完全培养基配置完成后，储存于2-8℃，有效期3个月。
5.2 肿瘤类器官的复苏 5.2.1 复苏冻存的类器官细胞前，根据复苏细胞操作流程中所需的肿瘤类器官完全培养基使用量， 取相应量的肿瘤类器官完全培养基，在冰上预冷5-10分钟备用。
5.2.2 从液氮罐中取出冻存的肿瘤类器官细胞，快速置于37℃水浴锅中融解。注意：在 37℃水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在1-2分钟内完全融解。
5.2.3 将融解后的类器官细胞和其冻存液快速转移至15ml无菌离心管，并添加 5ml的结直肠癌类器官完全培养基后，使用移液管轻轻吹打3次。
5.2.4 将15ml离心管置于离心机中，以300g离心3分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。
5.2.5 向收集的类器官细胞沉淀中添加1.1ml已在冰上预冷的结直肠癌类器官完全培养基，充分混匀获得类器官细胞悬液。
5.2.6 使用预冷的移液器吸头吸取120ul步骤1中Matrigel®基质胶（Matrigel®基质胶的终浓度约为10），加入至步骤4中的细胞悬液中，并充分混合后，置于冰上备用。
5.2.7 使用预冷的移液器吸头吸取0.3ml步骤5的类器官细胞和Matrigel®基质胶，滴入24孔超低附着微孔板中心位置。将上述培养板置于37℃培养箱中，静置30-50分钟，以促使Matrigel®基质胶固化。
5.2.8 待Matrigel®基质胶固化后，取出培养板，沿培养板壁缓慢加入0.3ml OrganoPro^TM结直肠癌类器官完全培养基，随后置于37℃、5%CO2 培养箱中继续培养。培养期间每 3 天向培养板中添加或更换0.3ml OrganoPro^TM结直肠癌类器官完全培养基，每 1-2 周对其进行传代培养或冻存。
5.3 肿瘤类器官的传代与冻存 5.3.1 在显微镜下观察肿瘤类器官的状态，当类器官密度达到500个/孔或单个类器官体积>300μm 时,进行传代，以保持类器官良好的状态和较快的增殖速率。
5.3.2 在无菌超净台中，将待传代培养板中的培养基和Matrigel®转移到15ml离心管中,加入8ml PBS,用枪头轻柔吹打均匀。
5.3.3 将含有类器官及培养基的 15ml离心管置于300g离心3分钟,小心移除上清，收集类器官沉淀。如混合物中存在大块 Matrigel 或类器官团块, 则需要继续吹打均匀或增加离心转速。
5.3.4 向收集的类器官沉淀中加入 1.5-2ml 肿瘤类器官传代酶解液 A，轻柔吹打，分散类器官团块，37℃孵育同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3-5个细胞的小细胞团状态。
5.3.5 加入5ml of OrganoPro^TM结直肠癌类器官完全培养基至酶解分散的类器官团块中, 用枪头轻柔吹打混匀，300g离心3分钟,去除上清，收集离心后的细胞团沉淀。
5.3.6 加入类器官冻存液进行冻存或加入OrganoPro^TM结直肠癌类器官完全培养基做后续扩增培养。 注意： a. 肿瘤类器官的酶解质量对肿瘤类器官传代或冻存后复苏的活率影响较大，消化过度或消化不足都会大大降低类器官传代或冻存复苏后活率。建议消化终点以类器官酶解打散后呈3-10 个细胞的小细胞团为宜。 b. 类器官传代比例需根据类器官传代前生长状态决定，处在生长状态良好的肿瘤类器官建议的传代比例为1：2-1：3传代。 c.类器官冻存密度建议为0.5-1X10⁶Cell/ml,放入液氮存储罐前，需在-80℃超低温冰箱中进行程序降温。-80℃超低温冰箱程序降温完成后需尽快放入液氮罐中冻存。