Amplex Red游离脂肪酸检测试剂盒

碧云天研发的Amplex Red游离脂肪酸检测试剂盒(Amplex Red Free Fatty Acid Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织或细胞样品中游离脂肪酸含量进行检测的试剂盒。通常0.2-2μl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒采用吸光度检测时，在10-100µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在1-100µM浓度范围内有良好的线性关系。使用本试剂盒进行荧光法检测时，检测灵敏度会显著提高，可以使用更少量的样品。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒不仅可以用荧光检测，也可以用吸光度检测，荧光检测比吸光度检测灵敏度约高10倍。整个检测过程约60分钟即可完成。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织或细胞样品的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

游离脂肪酸(Free fatty acids, FFA)，又称为非酯化脂肪酸(Nonestesterified fatty acid, NEFA)。游离脂肪酸通常和其转运蛋白白蛋白(Albumin)结合在一起。中性脂肪分解后可以产生游离脂肪酸。当肌肉活动所需能源葡萄糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪产生游离脂肪酸来充当能源物质使用，所以游离脂肪酸是进行持久活动所需的能量物质。游离脂肪酸也是导致氧化应激的物质之一，游离脂肪酸的浓度升高会诱导活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)的生成，从而诱导氧化应激，最终产生氧化损伤[1]。这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、脂类，还可作为功能性信号分子，激活细胞内多种应激信号通路，这些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关[2-3]。

游离脂肪酸是由油酸、软脂酸和亚油酸等多种脂肪酸组成，大部分游离脂肪酸与白蛋白结合，并存在于血液中。游离脂肪酸可以从消化道吸收进入血液循环，也可以通过脂酶水解脂蛋白复合物中的甘油三酯或胆固醇酯或者脂肪细胞内的脂酶水解储存的甘油三酯而产生。游离脂肪酸是机体的主要能量物质，血清中游离脂肪酸的浓度与能量代谢、糖脂代谢和内分泌密切相关。游离脂肪酸浓度的增加是饥饿的生理反应，但也参与肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病、代谢综合征等病理进程。游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。在许多肥胖相关的疾病当中，血浆中的游离脂肪酸都会显著升高，这可能是由于外周组织的胰岛素抵抗有关[4]。败血症和肿瘤等生成活性脂类激素的疾病，都可能与游离脂肪酸水平升高有关[5]。因此游离脂肪酸是临床和基础研究中常用的检测指标。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用荧光和吸光度两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理如图1所示。在ATP和辅酶A (Coenzyme A, CoA)存在的情况下，游离脂肪酸(Free fatty acids, FFA)在乙酰辅酶A合成酶(Acyl-coenzyme A synthetase, ACS)的催化作用下生成乙酰辅酶A (Acyl-coenzyme A, Acyl-CoA)、AMP和焦磷盐酸(Pyrophosphate, PPi)，生成的乙酰辅酶A进一步在乙酰辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase, ACO)的作用下和氧气发生氧化反应生成2,3-反式烯醇辅酶A (2,3-trans-Enoyl-CoA)和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵的荧光强度或吸光度来最终检测游离脂肪酸的含量。试卤灵的荧光强度和吸光度与游离脂肪酸的含量成正比。

图1.碧云天Amplex Red游离脂肪酸检测试剂盒(S0215)检测游离脂肪酸的原理图。

本试剂盒提供了棕榈酸(Palmitic Acid)标准溶液，可以通过设置标准曲线，从而计算出样品中的游离脂肪酸含量。本试剂盒对棕榈酸标准品的检测效果参考图2。

图2.碧云天Amplex Red游离脂肪酸检测试剂盒(S0215)检测游离脂肪酸的标准曲线。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在10-100µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在1-100µM浓度范围内有良好的线性关系。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供了便捷的检测裂解液。对于细胞或组织样品的制备，可以用本试剂盒提供的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备样品，也可以用异丙醇、甲醇/氯仿(1:2, v/v)等有机溶剂制备样品。经测试，本试剂盒提供的检测裂解液所制备样品的检测效果与异丙醇所制备的样品的检测效果相当，使用异丙醇制备的细胞或组织样品，还可以用于甘油三酯、甘油以及胆固醇和胆固醇酯的检测，因此优先推荐使用异丙醇。如果样品仅用于检测脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯的检测，不用于甘油三脂和甘油的检测，优先推荐使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay。使用异丙醇或者甲醇/氯仿(1:2, v/v)所制备的样品，样品最终用异丙醇溶解后，样品检测时异丙醇的体积不超过整个检测体系的10% (即100μl检测体系中不超过10μl)，不会对吸光度或荧光检测产生显著影响。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。如果样品仅用于检测游离脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯的检测，不用于甘油三脂和甘油的检测，可以优先考虑使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay。

按照使用说明操作，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red、酶混合物A和增强剂须避光保存。