聚合酶（GsmartI Pfu DNA Polymerase

浓度：5U/μL
货号：GWP100S、GWP100M、GWP100L
保存条件：-20℃
有效期：36个月
产品组成：

Components	GWP100S (500 U)	GWP100M (1000 U)	GWP100L (2500 U)
WizsmartTM pfu DNA  Polymerase (5U/μL)	100 μL	200 μL	500 μL
5× pfu PCR Buffer	3 mL	5 mL	13 mL

产品简介：
Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase适用于对PCR产物保真性要求高的实验，即便使用困难模板该酶也能精确快速的进行PCR扩增。Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase的高保真性使其成为克隆的最佳选择。该酶具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，3'-5'外切酶活性可以在聚合反应中纠正错误参入的碱基，使其具有较高的保真性，该酶不仅适合扩增短片段序列也适合扩增长片段序列，该酶PCR扩增产物为平末端，可以直接进行平末端克隆。
主要应用

• 高保真PCR扩增
• 扩增DNA片段用于基因表达克隆
• 扩增DNA片段可用于平末端连接
• 基因定点突变

扩增能力：

• 延伸速度为2kb/min
• 简单模板，如以λDNA为模板，可以有效扩增不超过12kb片段（≤12kb）
• 复杂模板，如以人基因组为模板，可以有效扩增不超过3kb片段（≤3kb）

活性单位定义：
用活化的大马哈鱼精子DNA做模板，74℃ 30min内摄入10nmol全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为一个活性单位，即1U。
注意事项：

• 推荐退火温度为引物Tm值－5℃；
• 延伸速度2kb/min；
• 50ul体系中Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase的用量为2.5 U；
• 必须使用dNTP，dUTP将导致PCR失败；
• Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase扩增产物为平末端dsDNA；

使用指导：
使用Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase的操作步骤建议：
打开前所有管子都需要轻轻混匀和离心以保证溶液的均一性和利用率，PCR反应液应放置于冰上配制。如果扩增多个样本，可以配制反应mix，最后加入Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase。

1. 参考下表配置反应体系：

成分	加入量/μL	加入量/μL
5× pfu Buffer	10	20
dNTP (10mM each)	0.5	1
Forward primer✲（20 μM）	0.5	1
Reverse primer✲（20 μM）	0.5	1
模板DNA	X	Y
WizsmartTM pfu DNA Polymerase	0.5 ul	1 ul
灭菌水	补水至50	补水至100

✲推荐的引物终浓度为0.2μM，但可以根据需要在0.1μM-0.5μM范围内变化。

2. 将反应管上下颠倒混匀数次，尽量避免产生气泡，最后使用微型离心机离心；
3. 按照下表设置PCR反应程序：

步骤	温度/°C	时间	循环数
预变性	95	4 min	1
变性	94	30s	25-35
退火	X℃	30s
延伸	72	Y
终延伸	72	5-10 min	1
Hold	4	+∞	1

备注：
将一对引物中较低的Tm-5℃设为退火温度；
延伸速度以1-2kb/min计算；
反应混合物的组分说明：

• 酶：酶的最佳用量取决于模板量和PCR产物的长度。一般50ul反应体系中用2.5U的Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase就能得到较好的实验结果；对于某些PCR，可以适当增加酶的用量，但是不要超过5U/50ul体系，建议最后一步加入Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase.
• Buffers：提供5× pfu Buffer，含Mg²⁺
•  关于dNTP相关说明：

Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase扩增需要使用dNTP ，dNTP中每种成分最佳浓度为100uM。Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase不能识别dUTP、dITP或其衍生物，故不能使用包含dUTP、dITP及其类似物的模板或引物。

• 模板：50ul 反应体系中，低复杂度的模板DNA（比如质粒、λDNA、BAC DNA等）用量1pg-100ng；高复杂度的基因组DNA模板用量为50-250ng，如果cDNA合成反应混合液，模板体积不要超过PCR总反应体积的1/10.
• DMSO（可选）

对于高GC模板，推荐的DMSO终浓度为3%；DMSO也可以用于超螺旋质粒的解旋和变性。如果反应体系中添加高浓度的DMSO，要降低退火温度，因为DMSO会影响引物的熔点。据报道10%DMSO可以使退火温度降低5.5-6.0℃.

反应条件建议：

• 起始变性温度：变性温度为95℃，由于Wizsmart^TM pfu DNA Polymerase具有较高的热稳定性，可以使用更高的变性温度。95℃起始变性温度下变性时间推荐使用4min，有些模板推荐使用更长的变性时间，变性时间可以延伸至5min.
• 变性温度：对大多数模板来说，94℃变性30s已经足够
• 引物退火：引物Tm－5℃退火30s；
• 延伸：延伸在72℃下进行，延伸时间依赖于扩增子的程度和复杂度，对于简单模板的PCR扩增，例如质粒、λDNA，推荐延伸速度为30s/kb；对于复杂模板的PCR扩增，例如人基因组、cDNA等，推荐延伸速度为60s/kb。

引物设计建议：

• 引物长度一般为20-30bp
• 引物3’端最后一个碱基最好是G或C
• 引物3’端最后几个碱基避免出现连续错配
• 引物3’端避免有发夹结构或碱基修饰，
• 如扩增编码区，引物3’端不要终止于密码子的第3位，以免影响扩增特异性和效率
• 正向引物和反引物的Tm值不要相差太大，Tm值尽量控制在55-65℃
• 引物的GC含量尽量控制在40%-60%之间
• 引物A、T、C、G应均匀分布，避免使用GC或TA含量高的区域

可能会遇到的问题及解决办法：

1. 无扩增产物或扩增效率低

1. 不要使用包含dUTP和dITP的引物；
2. 重复一次，排除操作误差；
3. 检查引物是否因储存不当降解；
4. 模板是否储存时间太长或是反复冻融导致降解；模板GC含量是否过高，过高可在反应体系中添加DMSO或甜菜碱等PCR增强剂；
5. 样本浓度低，增加模板量；
6. 检查DNA聚合酶是否失活；
7. 延长延伸时间；
8. 增加扩增循环数；
1. 优化退火温度；

2. 出现非特异性扩增或smear带：

1. 引物特异性差，引物与模板有非特异性结合，必要时重新设计引物；
2. 模板被污染或降解：重新制备模板；
3. 减少酶用量；
4. 缩短延伸时间；
5. 减少循环数；
6. 降低引物浓度；