T7 High Yield RNA Transcriptio

目录号：E131-01A/E131-R100

产品描述:

• 作为生物大分子，mRNA可通过体外转录（IVT，in vitro transcription）的方法大规模合成，T7启动子是目前转录效率最高的启动子之一，因此采用T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase）进行体外转录可简单快速获得大量的RNA分子。本试剂盒经过系列转录反应体系的优化，通过T7 RNA Polymerase从模板DNA T7启动子下游开始合成与DNA中一条链互补的RNA，操作简便快捷。
• 本试剂盒一个反应可以转录产生150-200μg的RNA，转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。

1. 合成单链RNA；
2. 合成高特异性RNA 探针；
3. 合成siRNA 前体；
4. 制作 RNA 剪接反应（RNA splicing）的前体。

1. 模板效率和孵化时间：

本试剂盒以1μg的模板投入量可以产生150-200 μg的RNA，然而，不同模板的产量会因模板的序列、结构、长度、纯度以及特定RNA聚合酶启动子的序列和长度而有所不同。影响转录产量的污染物包括核糖核酸酶或污染物，如苯酚、微量金属和SDS。

2. 优化的反应:

推荐的反应条件可适用于大多数模板的体外转录，但是，对于某些模板，可以通过延长反应时间(4小时-过夜反应)，增加模板的用量来提高产率。

3. 模板含量：

下表总结了我们在调控模板数量方面的经验。结果可能因使用的模板而异，将反应时间延长至4-6小时可增加RNA的产量。

4. 保持RNase-free环境：

• 使用无RNase管和移液枪；
• 处理含有RNA的试剂盒组件或样品时应戴手套，并经常更换手套，特别是接触到RNase的潜在污染源，如门把手、钢笔、铅笔和人体皮肤后。
• 不使用时，应将所有试剂密封好。在孵育过程中，将所有含有RNA的试管密封。

5.由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺成分，在低温时会与模板DNA形成沉淀，配制反应液时需在常温下进行，调整组分加样顺序，计算好体系，先加水、 buffer和NTP，最后加模板和酶.

疑难解答：

1. 质粒模板线性化时，如何选择限制性内切酶？

带有启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效

的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒需确保双链为平末端或5’端为突出结构。因此需要选择可以产生平末端或5’端为突出结构的II类限制性内切酶，并且酶的识别位点为稀有位点。

2. 转录模板的纯度有要求吗？

模板DNA应为RNaseA-Free、高纯度，建议OD260/280为1.8~2.0。

3. 转录模板必须要去除吗？

最好在转录结束后添加DNase I去除模板。

4. 转录产物产量低或转录失败：

建议做一个对照组和一个实验组。若对照组产量低，请联系近岸蛋白质技术支持。若对照组实验产量正常但实验组产量低，可能存在模板本身的质量问题导致产量低，请尝试以下方案解决：

a) 实验模板中有抑制反应的成分，建议重新纯化模板，确定模板定量及其完整性；

b) 实验模板序列问题，建议延长37℃反应时间，加大模板投入量或尝试其他启动子和RNA聚合酶。

5. 短片段转录产物产量低：

转录产物小于0.3kb时，延长反应时间或增加模板量可以提高RNA产量。

6. 产物电泳拖尾现象：

a) 实验操作过程被RNase污染；

b) DNA模板被RNase污染；

建议重新纯化模板DNA，所有实验过程注意RNase污染控制。

7. RNA产物片段大于预期：

质粒模板没有完全线性化或有义链3’端为突出结构，建议重新线性化质粒模板，确保线性化完全及线性化的质粒请确保双链为平末端或5’端为突出结构；

RNA存在未完全变性的二级结构，更换变性胶检测RNA产物 。

8. RNA产物片段小于预期：

a) 模板序列中包括类似于T7 RNA聚合酶的终止序列导致转录提前中止，建议更换RNA聚合酶尝试；

b) 模板中形成高级结构，建议加入SSB蛋白尝试；

c) RNase污染。