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产品简介：
3-氨基邻苯二甲酰肼是一种较强的化学发光物质，在存在辣根过氧化酶催化的条件下，可以被氧分子氧化成具有发光现象的中间体，当中间体从激发态衰变到基态时可以产生明亮的化学荧光，常用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。其高灵敏度能够检测pg级别的抗原，发光信号强烈持久，可以使用照相技术（X-光胶片曝光）或者其他成像方法检测。
保存条件：
避光2-8°C保存,一年有效。
操作流程：
1、转印膜及试剂准备
1.1常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。
1.2洗涤膜上的 HRP 标记二抗时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液 A 和 B 混合，放置使之升到室温，否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。
2、孵育及曝光
2.1用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触(约0.125ml/cm2膜)。室温孵育 3-5分钟，准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。
2.2用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。
2.3在 X 光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内，最好蛋白带面向上。
2.4在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。
注意事项：
1、为获得最佳实验结果，请务必优化实验条件，包括检测样品的用量、一抗、二抗稀释度以及杂交膜及封闭试剂的选择；
2、由于牛奶中含有内源性生物素，在使用亲和素/生物素系统时，封闭液中请避免使用奶粉；
3、在封闭缓冲液及所有抗体稀释液中加入高质量的吐温-20 （终浓度为0.05％ ），以减少非特异性结合；
4、整个免疫印迹实验过程应确保印迹膜始终处于湿润状态，避免干燥；
5、为获得最佳实验效果，抗体孵育及膜洗涤步骤中请使用摇床辅助完成；
6、在膜操作过程中请带手套操作或者使用干净的镊子，避免蛋白污染；
7、实验过程中，请使用干净的器材。保证非金属设备没有明显划痕，金属设备表面无锈。锈可能导致膜上带有污点或者高背景；
8、避光条件下，配制好的化学发光检测底物工作液可在室温下稳定8小时。如暴露于阳光或其他强光下，工作液会受影响。为获得最佳效果，可于棕色瓶中配制工作液，避免强光长时间的照射。正常实验室灯光短时间照射不影响工作液的使用；
9、蛋白过量或长时间曝光，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊；
10、发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光；
11、某些市售保鲜膜包裹印迹膜时会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜，例如“克林莱”牌子保鲜膜。
温馨提示：
为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。
