β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化 β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成 β-1,3-GA，因此 β-1,3-GA 活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。

测定原理：

β-1,3-GA 水解昆布多糖，内切 β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃ 保存；
试剂二：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10  的比例（建议称取约 0.1g  组织，加入
1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
 

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）：

试剂名称（μL）	测定管	对照管
样本	100	100
蒸馏水		100
试剂一	100

充分混匀，放入 37℃水浴 60 min

试剂二

600

600

充分混匀，95℃水浴 5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，550nm 处记录各管吸光值 A， 如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A 测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。


β-1,3-GA 活性计算：
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0958x -0.0192；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。   2、血清（浆）β-1,3-GA 活力的计算
β-1,3-GA(mg/h/mL)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷V1=10.438×(ΔA +0.0192)
3、细胞、细菌和组织中 β-1,3-GA 活力的计算
（1） 按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958 ×V1]÷(V1 ×Cpr)=10.438 ×(ΔA +0.0192)
÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /g 鲜重)=[( ΔA +0.0192)÷0.09585×V1]÷(W×V1÷V2)=10.438×(ΔA +0.0192)
÷W

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA(mg/h /104 cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0208×(ΔA+0.0192)

V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。