果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP 转化为果糖-1,6 二磷酸和 ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

测定原理

PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，bing酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；
试剂四：液体 8μL×1 支，4℃保存；

样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定

1. 在试剂二瓶中加入 17mL 试剂一和 1.13mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物） 或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2. 在试剂三中加入 1mL 蒸馏水充分混匀，冰上放置备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3. 在试剂四中加入 1mL 蒸馏水充分混匀，冰上放置待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4. 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四和 170 μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 10min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：不同匀浆组织中 PFK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则
说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min 或 5min,使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

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PFK 活力单位的计算

 

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）PFK 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol
果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=321×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖
-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol
果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.1605×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。

2. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）PFK 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol
果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=642×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖
-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=642×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol
果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.321×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。