产品简介
反转录试剂盒独立引物（Primer Flexible）是一款高效、便减少污染的高质量一链cDNA合成预混液， 包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反应 Buffer、RNA 酶抑制剂、dNTPs等一链 cDNA 合成所需的多种组分，还需加入RNA 模板、引物和水即可开始反应，操作非常方便。针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物，满足多样化的实验需求，可根据不同实验场景选择Oligo(dT)20VN 或Random hexamers 或 Gene Specific Primers。使用该逆转录预混液15分钟内最长可获得12 kb大小的cDNA。
从细胞中提取的 RNA 往往存在基因组 DNA 污染，如果逆转录前不将其去除，下游 qPCR 反应时基因组 DNA 与 cDNA 会同时被扩增（尤其当引物设计在同一外显子上时），从而影响基因表达定量准确性。本试剂盒采用 dsDNase 高效去除基因组 DNA 污染，dsDNase 能够特异性消化双链 DNA（dsDNA 或 DNA-RNA 杂合链中的 DNA 链），并且具有热敏感性，在逆转录温度下即可快速不可逆地失活。与传统使用 DNase I 去除基因组 DNA 污染的方法相比，dsDNase 无需额外加入 EDTA 进行失活，不仅节省实验时间，而且降低了对逆转录反应的抑制。
使用方法
一、 Total RNA
针对基因组含量低的RNA 样品(推荐方案)
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
模板RNAa | 50ng-1ug |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 ul |
dsDNase | 1 ul |
10× dsDNase Buffer | 1 ul |
Oligo(dT)20VN (50 μM) | 1 μl |
或 Random hexamers (50 μM) | 1 μl |
或 Gene Specific Primers (50 μM) | 0.1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 ul |
a. 推荐采用试剂盒提取的 RNA 作为模板。
② 轻柔吸打混匀， 瞬离；
③ 37℃ 温育2min， 以去除基因组DNA 污染；
④ 55℃ 温育15 min;
⑤ 反应结束后， 85℃ 温育5 min 以终止反应；
⑥ 迅速将获得的cDNA 置于冰上， 用于后续实验;或立即保存于-20° C。
针对基因组含量高的RNA 样品
1.基因组DNA污染去除
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
Total RNAa | 50ng-1ug |
dsDNase | 1ul |
10× dsDNase Buffer | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 10 ul |
a. 推荐采用试剂盒提取的 RNA 作为模板。
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 37℃温育 2 min，以去除基因组 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因组 DNA 污染严重，可适当延长 37℃温育时间至 5 min。
④ 65℃温育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一链 cDNA 合成
①于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量（实验组） |
“实验 (1)”反应产物 | 10 μl |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 μl |
Oligo(dT)20VN (50 μM) | 1 μl |
或 Random hexamers (50 μM) | 1 μl |
或 Gene Specific Primers (50 μM) | 0.1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 55℃温育 15 min；
注：若目标 RNA 不含 Poly(A) 结构，可预先25℃温育 10 min。
④ 反应结束后，85℃温育 5 min 以终止反应；
将获得的cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于 -20℃。
注：1.后续实验为克隆实验，若RNA来源于真核生物，只需使用 Oligo (dT) VN 即可，加入 Random hexamers 会降低全长 cDNA 的产量；若 RNA 来源于原核生物，只需使用 Random hexamers 或 Gene Specific Primers。
2.后续实验为qPCR，请同时加入Oligo(dT) VN和Random hexamers以获得mRNA不同位置逆转录效率均一的cDNA。
二、miRNA
1.基因组去除
①于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
miRNA | 10 pg~200 ng |
dsDNase | 1ul |
10× dsDNase Buffer | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 10 ul |
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 37℃温育 2 min，以去除基因组 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因组 DNA 污染严重，可适当延长 37℃温育时间至 5 min。
④65℃温育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一链 cDNA 合成
①于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量（实验组） |
“实验 (1)”反应产物 | 10ul |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 μl |
Stem-loop primer(5 μM)b | 1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
b. 茎环引物推荐终浓度0.25 μM，可在0.1~0.5 μM范围内进行调整。
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 55℃温育 15 min；
④ 反应结束后，85℃温育 5 min，以终止反应；
⑤ 将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于 -20℃。
miRNA 茎环引物及 qPCR 引物设计
1. Stem-loop RT 引物设计：
基于通用的茎环结构，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；
2.以 miR-1-5p 为例，其序列为：CAUACUUCCUUACAUGCCCAUA，只需在通用茎环序列后加上 miRNA 3' 末端的 6 个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC“TATGGG”；
3. qPCR 上游引物设计：miRNA 序列除去 3' 端 6 个碱基的剩余部分作为上游引物，如 miR-1-5p 的上游引物为 ( 注意把 U 改 为 T)：CATACTTCCTTACATG。检查引物的 Tm 值，如果 Tm 值较低，则在 5' 端加 GC 使 Tm 值接近 60℃。因此 miR-1-5p 的上游引物可设计为：GCCGCCATACTTCCTTACATG，60.3℃；
4. 下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT；
5. 引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做熔解曲线来检测引物的特异性；同时最好将 PCR 产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要 3% 以上的琼脂糖胶）。
注意事项
1.所有试剂使用前请轻轻上下颠倒混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用；
2.所用的离心管、枪头等耗材均需保证 RNase-free；
3.为了防止 RNase 污染，请保持实验区域洁净；
4.操作时需穿戴干净的手套、口罩。
