CUT&Tag-IT® Spike-In Control,

靶标和片段化下的切割 （CUT&Tag）已成为一种在全基因组范围内分析目标组蛋白修饰定位的强大方法。Active Motif 应用这种方法使用我们的 CUT&Tag-IT^® R 环检测试剂盒在全基因组范围内研究 DNA-RNA 杂交 R 环。CUT&Tag-IT^® R 环检测试剂盒利用基于 CUT&Tag 的方法，使用针对细胞样品的专门优化方案和我们的DNA-RNA 杂交（克隆 S9.6）抗体，在全基因组范围内分析 R 环。

由于样品之间细胞数量和 NGS 测序统计数据的差异，生物学差异可能会被掩盖。通过将 Active Motif 的CUT&Tag 归一化策略应用于 CUT&Tag-IT R 环检测数据，可以揭示样品之间的真实差异。

CUT&Tag-IT^® 尖峰控制，R-loop 亮点：

• 比较样品之间的 CUT&Tag-IT R-loop 检测试剂盒数据集
• 只需将 Spike-In Nuclei， R 环添加到实验样品中，并使用 Spike-In Antibody， Mouse 和 DNA-RNA Hybrid mAb（克隆 S9.6）进行 CUT&Tag
• 获得归一化因子并揭示样品之间的真实差异

CUT&Tag-IT^® 尖峰控制，R 回路数据

由于 Spike-in 抗体与哺乳动物样品缺乏交叉反应性，因此 Active Motif 的 CUT&Tag 归一化策略¹ 可应用于任何哺乳动物 CUT&Tag 检测反应。可能需要优化每个 CUT&Tag 反应使用的冻存果蝇细胞核和抗体的量，以使果蝇读数仅占总测序读数的 5-10%。

对于针对 R 循环的 CUT&Tag，建议使用 1：10 的 spike-in：test 样本比例。为了证明这种方法的实用性，通过设置具有不同起始细胞数量的 CUT&Tag 反应来模拟 DNA-RNA 杂交 R 环水平差异。将不同数量的冷冻保存的人 K562 细胞（500,000、375,000、250,000、125,000、62,500 和 31,250 个细胞）与 50,000 个冷冻保存的果蝇细胞核相结合用于每个实验（图 1）。

在 CUT&Tag R 环加标测定中评估 DNA-RNA 杂交体，每个实验都包含生物学重复。对文库进行定量和测序，每个样品的深度为 40-5000 万个读数。然而，对每个样品进行测序至相等的读取深度掩盖了每个样品起始量的差异（图 2）。因此，需要加标归一化来揭示起始材料² 的差异。对于归一化，使用果蝇读数最少的样品在样品中生成归一化因子，然后应用这些因子对每个样品的人类读数计数进行相应的下采样。在获得标准化的人类读取计数后，使用标准的 CUT&Tag 管道生成大佬的峰值检出。归一化结果与输入细胞数相关，因此可以揭示实验样品之间的差异（图 3）。

引用

1. Egan， B. et al. （2010） 公共科学图书馆一号。11（11）：e0166438
2. Taruttis et al. （2017） 生物技术 62：53-61