实验原理

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利⽤抗原与抗体之间的专⼀性作⽤为基础，从 ⽽⽤于研究蛋⽩质与蛋⽩质之间相互作⽤的⼀种⽅法。抗体与细胞裂解液或表达上清中 相应的蛋⽩结合后，再与ProteinA/G偶联的Sepharose或MagneticBeads孵育，通过 离⼼或者借助磁⼒架获得ProteinA/G珠⼦-抗体-⽬的蛋⽩复合物，在⾼温及还原剂的作 ⽤下，抗原与抗体解离，收集上清，上清中包括抗体、⽬的蛋⽩和少量的杂蛋⽩。

 

实验流程

 

试剂盒组分、操作步骤等更多细节请查看zuixinban说明书

 

常见问题

Q1：通过Co-IP后WB验证发现，没有想要的目的条带？

1.有可能是样品被蛋白酶降解，对应的策略是需要添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融。 

2.有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调整IP或WB抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。

3.抗体亲和力太低，选用适合于IP或者WB的抗体。

4.有的IP抗体未与磁珠结合，这种情况需选用适合IP的磁珠。

5.若Tag未暴露在融合蛋白构象的表面，则需改变Tag融合表达部位。

6.裂解液盐碱度太高，需用低盐碱度的裂解液。

7.抗体选择不当，更换抗体。

 

Q2：通过Co-IP后WB验证发现，虽然可见目的条带，但是背景很高：

多方面原因造成：

1.由于非特异蛋白结合导致背景高，若要避色非特异性蛋白结合，则需要在无血清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前用protein(A/G)珠子预洗，在免疫沉淀后 增加漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。

2.实验仪器或试剂被污染，使用洁净的仪器及试剂。

3.转移膜上的非特异吸附导致背景高，实验操作过程中戴手套，使用镊⼦来取， 不要接触膜转移面。

4.制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体，则在制备样品后进⾏短暂超声处理(3次，每次5秒钟 )，然后离心，取上清后进行后续试验。

5.洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并增加洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。

6.可能有非特异性蛋白吸附于珠子上，则须进行Preclearing以排非特异性吸附。

7.抗体本身待异性不好可能导致背景高，则须选择合适的抗体，可以考虑单抗。

8.使用了过多的细胞或组织进行裂解导致背景高，则须减少样本量，推荐100- 500μg细胞裂解液。

9.蛋白降解也可能出现高背景的情况，尽量使用新鲜制备的样品。
 

Q3：CO-IP实验中，为什么有时无法检测到预期的蛋白质互作？
解析：这可能是由于胞内蛋白互作水平较低或没有互作。此时，可以尝试增加蛋白裂解物或进行诱导处理以提高互作水平。同时，也可能是由于细胞裂解液使用不当或目的蛋白未被有效洗脱。确保使用合适的裂解液和洗脱液，并优化洗脱条件，可以提高蛋白质的互作检测效率。

Q4：在进行CO-IP实验时，如何选择抗体？
解析：抗体的选择对于CO-IP实验的成功至关重要。首先，应确保抗体具有较高的特异性和亲和力。其次，为了避免假阳性结果，最好选择两个不同种源的抗体进行实验。这样可以排除因抗体与珠子或检测试剂的非特异性结合而导致的干扰。

Q5：如何避免CO-IP实验中的假阳性结果？
解析：为了避免假阳性结果，可以采取多种措施。例如，设置阴性对照实验，利用抗体对应的不含靶标蛋白的蛋白进行处理，以排除抗体抗原对实验的影响。此外，优化实验条件，如减少洗涤次数、降低洗涤强度等，也可以减少非特异性结合的可能性。

Q6：CO-IP实验结果不稳定，如何处理？
解析：实验结果的不稳定性可能由多种因素引起，如样品处理、抗体质量、实验操作等。为了提高实验结果的稳定性，可以优化样品处理过程，确保蛋白质的稳定性和活性；同时，选择高质量的抗体并严格按照操作说明进行实验；此外，多次重复实验并统计分析结果也是提高稳定性的有效方法。

Q7：如何评估CO-IP实验的成功率？
解析：评估CO-IP实验的成功率可以从多个方面进行考虑。首先，观察免疫共沉淀产物的质量和数量，如果产物清晰且数量适中，则说明实验效果较好。其次，通过Western Blot等验证手段检测共沉淀产物中的目标蛋白，如果能够检测到明显的信号，则说明实验成功。此外，还可以比较不同实验组之间的差异和重复性，以评估实验的稳定性和可靠性。

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