产品优势
- 快速简单的一体化实验方案: 从总RNA到可用于测序的文库时间不超过4.5小时；
- 每个转录本仅有一个片段产生—可进行全基因组范围的基因表达分析；
- 能稳定、灵敏检测低丰度的转录本；
- 适用于低起始量（100pg（FWD）或10ng（REV）总RNA）及低质量RNA（如FFPE样本）；
- 可高效替代芯片检测或传统的RNA测序，友好匹配自动化工作站；
- 在Blubee基因组分析平台上免费进行数据分析；
- NEW! 节约成本，优化的globin mRNA去除流程可用于QuantSeq文库构建；Dual indexes能支持9,216个 i5/i7 index，或者可选择96个unique index，同时提供能够检测、排除扩增偏好性的UMIs
QuantSeq 文库构建试剂盒通过oligo dT引物特异逆转录含poly (A)尾的mRNA，第二链使用随机引物进行合成。由于插入片段的大小是由第二链合成引物和poly(A)尾之间的距离决定的，因此无需额外进行 RNA 片段化。随后的PCR可以提供9,216个不同的i5/i7index组合用于illumina平台，48个index 用于Ion Torrent平台。能够实现更多样本混样测序。
Lexogen提供两个版本的Illumina Quantseq 3' mRNA-Seq文库构建试剂盒，不同处在于Illumina接头序列的位置。下图绿色的是Read 1的序列，蓝色的是Read 2的序列。Quant-Seq Forward (FWD) 在第二链合成的引物中包含Read 1序列（Fig. 1, 左）。因此，测序的方向是朝向poly(A)尾的方向。推荐使用这种方法进行基因表达的分析。如果研究关注的是转录的3’端序列或者双端测序策
略，推荐使用QuantSeq Reverse (REV)，Read 1 接头序列由oligo-(dT)引物引入（Fig. 1, 右）。
Figure 1 | QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD 文库构建试剂盒(左图) 和 QuantSeq 3' mRNA-Seq REV文库构建试剂盒 (右图) 建库流程图。左边：QuantSeq FWD试剂盒Read 1（从绿色P5接头部分开始）测序对应的是靠近mRNA 3' 端序列，可以使用Illumina测序引物进行测序，且费用较低。右边：QuantSeq REV 试剂盒测序位置是 Read 1 和Read 2 的互换，Read 1 能够直接检测到转录本的末端。QuantSeq REV Read 1测序需要定制化的测序引物（CSP,包含在试剂盒内）。
性能表现
3’ 端链特异性比对
以FDA提供的测序质控 (SEQC) 标准样品A和B为样本（A和B分别是ERCC外源RNA与有参RNA的混合物1和混合物2）1,2，用QuantSeq试剂盒进行文库构建，测序数据与近期生物分子资源实验室协会 (ABRF) 发布的NGS研究中的mRNA-Seq数据组比对3。在常规mRNASeq中，测序Reads覆盖转录本的全长，而QuantSeq的Reads仅覆盖转录本的3’端(Fig.2)。QuantSeq在精确检测基因表达水平的同时，节省了大于90%的测序深度。由于spike-in转录本(RNA质控品)仅来源于正义链的转录，因此链特异性的评估可以不依赖于于任何基因组注释。在各种情况下QuantSeq数据均显示出高于99.9%的链特异性，而两个被评估的mRNA-Seq SEQC数据集(data sets)链特异性仅分别为93.4%和97.8%3。QuantSeq可降低噪音，能够实现准确检测及定量反义转录本。
Figure 2 | QuantSeq和标准mRNA-seq的覆盖度与标准化转录本长度的对比。RSeQC是所有转录本（面积），ERCC混合物（线性，
QuantSeq (彩色)和mRNA-Seq (灰色) ）的覆盖度信息。曲线面积值(AUC)作为测序覆盖度的测量尺度。
QuantSeq量化范围宽--6个数量级
为了分析QuantSeq的基因计算准确性，用ERCC 的spike-in转录本覆盖reads数与input的分子数作图进行分析 (Fig.3)。在线性模型评估和Spearman关联性评估中，QuantSeq展现出了非常高的input-output关联性和基因表达测定的准确性。
Figure 3 | QuantSeq 获得的ERCC reads数与给定的input间存在极好的关联性。
基因差异表达分析
通过使用“erccdash- board” 软件 4，对QuantSeq和常规mRNA-Seq的基因差异表达的检测能力进行了对比。当测序的Reads数由10M降低到0.625M，QuantSeq维持了相当高的曲线面积值（AUC 0.860-0.897），而常规mRNA-Seq的曲线面积值较低，在0.736到0.776之间(Fig. 4).
Figure 4 | QuantSeq和常规mRNA-Seq在基因差异表达分析上的性能表现。给定的ERCC ExFold Spike-In Mix1和Mix 2间的倍数
变化(4:1 / , 1:1.5 / , 1:2 / ) 用于评估真假阳性率(TPRs 和FPRs)。好的基因差异表达检测体现在最大值为1的曲线面积(AUC)。用AUC对 检测到的ERCC RNA reads进行评估(测序数据量从10 M降到0.625 M)。
Quantseq在低质量RNA中的表现
Quantseq在高质量和低质量（FFPE）样本中有很好的相关性
用同一来源的不同质量RNA样本进行比较，评估Quantseq适用于高度降解的样本（如FFPE样本）的能力。
将人的MOLP-8肿瘤细胞系分成两份，一份进行新鲜冷冻，一份处理成FFPE样本，从而使同一个来源的样本得到不同质量的RNA。用RIN值(RNA完整度)来区分RNA的质量。RIN值大于8表示RNA质量高。对于严重降解的样本，RIN值不适用于质量的评估，因此使用DV200值(大于200 nt的RNA片段的分布值)来表示RNA质量，低完整度的RNA对应低DV200值。
RNA提取后，FFPE样本的DV200值为87% (RIN值2.8)，冷冻样本RIN值为8.3。使用50ng总RNA，用QuantSeq FWD 试剂盒进行文库构建。FFPE样本提取的RNA，即使DV200值低至23%(数据未显示)，Quantseq 仍能成功构建文库。FFPE样本有对应的低质量RNA建库操作流程，对应冷冻样本，应用标准操作流程。文库在Hiseq2500上进行用 1x 50 bp读长测序(Fig.5)。
Figure 5 | 安捷伦2100 HS DNA芯片检测QuantSeq 3’mRNASeq FWD试剂盒构建的FFPE(蓝色)或冷冻样本(红色)的RNA文库。对于降解的样本来说，文库是一个较为平滑的分布，没有明显可见的锯齿突起，且整体片段偏小。平均片段长度204bp(FFPE)和286bp(冷冻样本)。
覆盖度与转录本的长度的相关性显示覆盖度关注于转录本的3’端，与RNA的质量无关(Fig.6)。但是，由于QuantSeq FWD文库对poly(A)端进行测序，覆盖度取决于文库的片段大小和测序读长。FFPE样本文库明显比冷冻样本文库短，因此，会更多的读取转录本的3’端，并反映在覆盖曲线中。
Figure 6 | 来源于FFPE-RNA(蓝色)和冷冻保存RNA(红色)的NGS文库的Quantseq read均一化覆盖度与百分位数转录本长度的相关性。
FFPE-RNA文库和冷冻保存RNA文库的基因表达的相关性很高（R² = 0.86），表示Quantseq能在不同质量的RNA中表现稳定(Fig.7)。
Figure 7 | FFPE和冷冻样本的基因表达的相关性。
Quantseq有非常高的灵敏度。测序量在26.5M reads时， RNA完整性好的新鲜冷冻样本中检测到25,842个基因(数据未显示)。当单个样本测序数据量在2.5M时，在新鲜冷冻样本中检测出20,081个基因，且每个基因至少有1个read；相应的，在FFPE样本中能检测到15,190个，两者有24%的差异(Fig.8)。但是，当阈值提高到5或者10个reads/基因时，差异分别下降至3%和1%。这些比对结果表明，QuantSeq能够可靠地对冷冻保存和FFPE样品进行基因表达分析。两者之间在低表达基因检测存在的差异，是由于FFPE样本在处理、储存及回收过程中低拷贝转录本很容易降解至无法检测到。
Figure 8 | QuantSeq在FFPE和冷冻样本中以2.5 M的统一测序深度检测到的基因的韦恩图(reads/基因的阈值分别为1, 5, 10)。
Quantseq用oligo(dT)引物进行逆转录，每个转录本只产生1个片段。这样能够使得无论RNA的质量如何(包含FFPE样本)都可准确定量。常规的mRNA-seq操作流程旨在覆盖整个转录本，但是在使用降解样本时将导致严重的3’偏好性。因此，相对于其他用Poly(A)分选mRNA操作流程，Quantseq 3’mRNA-Seq更有效的对低质量的样本进行建库。
Globin Block模块在血液RNA样本上的表现
使用Globin Block在QuantSeq文库构建过程中无需额外的操作步骤
对于生物学及疾病相关研究，血液是一种信息量大且易于获得的样本。Globin mRNAs(HBA1, HBA2, HBB)占血液总RNA的50-80%，严重影响了基因的检测和定量的灵敏度。其他Globin RNA的去除方法需要对RNA进行前处理，需要高起始量的RNA，额外增加成本。Lexogen Quantseq的Globin Block模块能通过简单的方法(仅是简单的试剂互换，无需额外的操作步骤)直接在建库流程中去除Globin mRNA。适用于input量低至50ng的血液RNA。
Globin Block模块是专门为QuantSeq 3’mRNA-Seq建库试剂盒设计的。Globin Blockers在Quantseq流程中引入优化的Globin RNA去除流程(RS-Globin Block)：Globin Blockers结合Globin第一链cDNA，阻止GlobinmRNA形成双链cDNA。Globin Block兼容自动化平台，可用于人、猪样本。对于其他物种，请联系我们。
Globin Block可降低Globin RNA Mapped Reads至0.7%
使用Globin Block模块的文库比标准Quantseq文库显著降低了总Globin RNA mapped read百分比(Fig.9)。在白膜层样品和全血中，使用Globin Block模块可使总Globin RNA mapped read百分比分别低至0.7%和9.7%。
Figure 9 | 特异性比对到人或猪的Globin RNA上的Reads百分比。全血RNA，使用标准QuantSeq FWD操作流程的文库对比QuantSeq+Globin Block流程的文库。
1无红细胞裂解的SPLIT RNA提取试剂盒（Lexogen）；2 PAXgeneBlood RNA Kit (Qiagen, 包含红细胞裂解)；3 包含红细胞裂解SPLIT RNA 提取试剂盒；4 Preserved Blood RNA Purification Kit I (NorgenBiotek, 不包含血细胞裂解)。
Globin Block可提高基因检出率
Fig.10总结了标准和+Globin Block文库间基因检出的差异情况。在CPM（每100万）阈值为0.5时，两者检测到的基因大部分相同。但在+Globin Block文库中特别检测出3,690、3,030、2,825个基因，而标准Quantseq文库中仅特别检出14、17、136个基因。
Figure 10 | 使用Globin Block提高人、猪全血中基因检出率。全血RNA分别使用标准QuantSeq FWD和QuantSeq +Globin Block构
建文库。基因检出数通过CPM均一化read计数（阈值大于0.5）。检出的基因列表进行比对，重合部分（深绿色）、QuantSeq FWD特有部分（蓝色）、QuantSeq +Globin Block特有部分（浅绿色）。
1无红细胞裂解的SPLIT RNA提取试剂盒；2PAXgene® Blood RNA Kit (Qiagen,包含红细胞裂解)；3包含红细胞裂解的SPLIT
RNA提取试剂盒 ；4Preserved Blood RNA Purification Kit I (Norgen Biotek，不包含血细胞裂解)；CPM: 每百万计数。
QuantSeq 自动化
Lexogen可提供QuantSeq 3’ mRNA-Seq文库构建流程的自动化版本。在自动化平台上构建Illumina兼容的 3’mRNA-Seq文库，能够提供9,216个i5 / i7 index组合，能实现高通量、大规模基因表达检测。自动化减少了手动操作的时间，提高通量，避免手动操作误差和样本错乱。
AutoQuantSeq 能够兼容PE、Hamilton、Agilent、Eppendorf、Beckman自动化平台。
自动化 QuantSeq 数据分析
Bluebee Genomics Platform免费为QuantSeq 3’ mRNASeq文库构建试剂盒(FWD和REV)的数据提供分析。Lexogen为每个试剂盒提供一个密码，使用者可以登录该平台分析数据。也可用Partek Flow (license required)平台进行数据分析。使用者可以直接在Partek Flow导入原始测序数据，然后进行自动化分析。也可进行定制化分析。
订购信息
| 货号 | 产品 | 规格 |
| 012.24A | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent, Barcode Set A (01-24), 24 preps | 24 |
| 012.24B | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent, Barcode Set B (25-48), 24 preps | 24 |
| 015.24 | QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) for Illumina, 24 preps | 24 |
| 015.96 | QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) for Illumina, 96 preps | 96 |
| 015.2x96 | QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) for Illumina, 2x96 preps | 2x96 |
| 015.384 | QuantSeq 3‘ mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) for Illumina HT including i5 Dual Indexing Add-on Kit (5001-5004), 384 preps | 384 |
| 016.24 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) for Illumina with Custom Sequencing Primer, 24 preps | 24 |
| 016.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) for Illumina with Custom Sequencing Primer, 96 preps | 96 |
| 016.2x96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) for Illumina with Custom Sequencing Primer, 2x96 preps | 2x96 |
| 113.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Set A1, (UDI12A_0001-0096), 1 rxn/UDI | 96 |
| 114.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Set B1, (UDI12B_0001-0096), 1 rxn/UDI | 96 |
| 115.384 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Sets A1-A4, (UDI12A_0001-0384), 1 rxn/UDI | 384 |
| 129.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Set A2, (UDI12A_0097-0192), 1 rxn/UDI | 96 |
| 130.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Set A3, (UDI12A_0193-0288), 1 rxn/UDI | 96 |
| 131.96 | QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Set A4, (UDI12A_0289-0384), 1 rxn/UDI | 96 |
