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产品名称：外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）
产品用途：适用于细胞上清（尿液），可以提取 400ml 细胞上清液
保存方式：常温18-25℃；运输条件：常温；
产品描述：
外泌体是由细胞分泌的包含RNA和蛋白质的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能，在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子；然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。
外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。宇玫博生物自主开发的外泌体提取纯化试剂盒，组分经过优化处理，适用于细胞培养上清液中的外泌体提取，并搭配纯化过滤装置，可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒，可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。
产品组成：
| 组分名称 | UR52120 | UR52121 |
| Exosome Concentration Solution* | 12 mL | 120 mL |
| Exosome Purification Filter* | 2 Tubes | 20 Tubes |
* Nuclease-free, Sterile
产品优势：
涵盖组织、细胞上清、血清血浆、乳液、尿液以及其他体液等多种样本；
针对不同样本，预处理、提取、纯化试剂做差异化配方；
样品处理量大，可达同类产品5倍以上；
外泌体可用于细胞共孵育和组学研究；
专注于外泌体提取和配套试剂盒研发；
价格便宜，为您大规模研究节省成本；
数百篇参考文献让您放心使用无忧购；
质控数据：
牛奶 细胞上清 血清
操作规程
一、 样品预处理
1、取样：
1) 冻存样品：从冰箱取出后于25℃水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；
2) 新鲜样品：收集样品后置于冰上；
2、离心去细胞颗粒：将样品转移至离心管中，于4℃以3000 g离心10 min，去除样品中的细胞颗粒；
（注：若沉淀较多，可3000 g，10 min重复离心1次，取离心上清液。）
3、离心去杂质碎片：将上清液转移至离心管中，于4℃以10000 g离心10 min，去除样品中的杂质碎片；
（注：若沉淀较多，可10000 g，10 min重复离心1次，取离心上清液。）
4、上清液转移：去除细胞杂质碎片的离心上清液转移至新的50 mL离心管中；
5、上清液浓缩：
（注: 此步骤仅针对干细胞、免疫细胞、神经细胞、悬浮细胞等外泌体分泌量较少的细胞种类。）
通过 10 kD ~ 100 kD规格的超滤浓缩离心管对细胞上清液进行3~5倍的浓缩，收集超滤离心柱上室中的液体，外泌体存在于该液体中。
超滤浓缩离心管的具体使用方法请咨询产品的厂商，推荐品牌：ThermoFisher、Millipore、Sartorius、PALL。
二、提取外泌体
1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosome Concentration Solution（ECS试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）
| 样品名称 | 样品剂量 | 加入ECS剂量 |
| 细胞培养上清液 | 20 mL | 5 mL |
2、溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，涡旋振荡器混匀1 min，再放置于4℃静置≥2 h；（注：增加静置时间可提高外泌体得率，建议干细胞、免疫细胞、神经细胞、悬浮细胞上清液可静置过夜，但静置时间不可超过24h。）
3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：为了尽可能吸净上清液，将离心管于4℃以10000 g离心2 min，通过移液器吸取管底残留的溶液。）
4、外泌体重悬：取1×PBS均匀吹打离心沉淀物和离心管壁四周（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中；（注：部分样品沉淀较少，有时肉眼不可见，需要仔细吹打离心管壁四周和底部。）
| 细胞上清样品体积 | 推荐加入PBS剂量 |
| 20 mL | 0.2 mL |
（注：在沉淀较少时或者为了获得高浓度的外泌体时，可减少PBS剂量至0.1 mL；当沉淀量较多，可增加PBS剂量至0.3 mL；其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算。）
5、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可12000 g, 2min离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液。）
三、纯化外泌体
1、纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：如果外泌体量较多时，可能会出现堵塞EPF柱的情况，此时则需将上室中残留的上清液转移至新的EPF柱进行纯化。）
2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以50-100 μL体积进行分装保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。
操作视频
通过手机扫描二维码观看“如何从细胞上清液中提取外泌体？”
（注：由于不同细胞来源的上清液差异较大，本视频供使用者学习外泌体提取试剂盒的整体操作流程，更为详细的操作步骤和操作细节以说明书内容为准。）
储存条件
本产品在室温可稳定保存12个月，使用前须充分混匀。
注意事项
本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途。
常见问题解答（FAQ）
1、外泌体提取纯化试剂盒如何保存？
室温保存（10℃~30℃），无需低温保存。
温度过低时ECS试剂会出现冻结状态，此时用65℃水浴1h进行解冻即可。
2、外泌体提取纯化试剂盒能否分离纯化 200-1000nm 直径的囊泡？
不能，本试剂盒不适用于直径大于 200nm 囊泡的分离。粒径在200nm以上的属于大囊泡，而非外泌体。
3、本试剂盒适用于哪些种类样品中的外泌体提取？
除细胞上清液外，本试剂盒还可用于尿液及其他低密度体液（如脑脊液、腹水、羊水、胸腔积液、唾液等）的外泌体提取。
4、本试剂盒提取过程会用到哪些仪器和耗材？
需要用到：低温高速离心机、涡旋振荡器（Vortex）、移液器、离心管（1.5mL、50mL）。
5、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存？
可以。
长期保存请放置于-80℃，无需加冻存液；短期保存（1-2 天内）则放置于4℃即可。
6、培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？
多数情况下，细胞在体外培养时需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下两种方法：
（1） 将细胞培养用的血清通过 1×105 g 超速离心 >10h以去除血清外泌体；
（2） 选择无血清完全替代培养基进行细胞培养，推荐“外泌体专用无血清培养基 UR51102”。
7、无外泌体血清（或者外泌体专用培养基）在什么时候使用？
l 使用“无外泌体血清培养基”：
细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞汇合度在 60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基，继续培养 24-48h，细胞汇合度达到 80%-95%左右时收取上清，该上清液即可用于提取外泌体。
l 使用“外泌体专用无血清培养基”：
1) 待细胞汇合度~50%时，移去原有完全培养基，添加“新培养基”进行培养，新培养基由50%“外泌体专用无血清培养基”+ 50%完全培养基组成；
2) 待细胞生长汇合度约为70-80%时，移去培养基；
3) 使用1×PBS溶液将细胞润洗2-3次；
4) 加入外泌体专用无血清培养基继续培养24-48h，待细胞汇合度到80%-95%时收取细胞培养上清液，该上清液即可用于外泌体提取实验。
8、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取？
会的。
在收获细胞时，应确定死亡细胞占比不超过 5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量囊泡，它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体，同时易堵塞 EPF 纯化柱。
9、准备做细胞外泌体 Small RNA 的 NGS 测序，初始样品量需要准备多少？
普通肿瘤细胞系推荐使用 50mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、免疫细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先通过 10 kD~ 100 kD的 超滤浓缩离心管浓缩3~5倍（超滤柱上层液体即为浓缩后的样品），准备 50mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。
10、细胞上清液的浓缩倍数该如何选定？
由于不同细胞在不同培养条件下外泌体分泌量差异较大，因此针对上清液的浓缩倍数无法给出具体数值。建议先选定一个倍数进行样品浓缩，以外泌体纯化过程中EPF柱堵柱现象作为浓缩倍数是否合适的依据，如果EPF柱出现堵柱现象，则可适当降低超滤浓缩倍数。
11、加了 ECS 液离心之后无沉淀，这个现象正常吗？
由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、免疫细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，加了 ECS 液离心之后肉眼无法观察到沉淀，在重悬时使用 PBS需要仔细吹打离心管壁四周和底部（避免剧烈吹打）。针对提取后的外泌体应先进行 NTA 粒径检测或 BCA 蛋白定量检测，再决定是否进行后继实验。
12、在纯化过程中，EPF 柱为什么会出现堵塞现象？
(1) 可能是因为细胞培养时间过长产生较多细胞碎片（样品离心预处理时不充分，仍有杂质残留）所致。若杂质残留较多（肉眼可见），请将上清液转移至新离心管，10000 g，10 min离心2-3次至无明显沉淀，每次离心收集上清液。
(2) PBS重悬的外泌体初始液12000 g，2 min离心2-3次至无明显沉淀，每次离心收集上清液，上清液再进行EPF柱纯化。
(3) 建议：细胞培养使用低血清或者无外泌体血清或者外泌体专用无血清培养基，培养时间控制在24-48h左右 ，收集上清液时培养基颜色正常，不要等到偏黄色时再收集上清液。
13、EPF柱是否可以多次使用？
不能重复使用。
过量的样品会超出纯化柱的使用极限，会严重影响分离效果。
14、外泌体如何保存？
纯化后的外泌体可于 4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。
15、如何鉴定提取的外泌体？
通常会用到：透射电镜检测（形态）、NTA粒径检测（大小）、Western blot 检测等方法对提取的外泌体进行鉴定。在进行 Western Blot 检测时，常用的外泌体标志蛋白有CD63、CD9、CD81、TSG101 等。
外泌体标志物蛋白检测，推荐“外泌体CD63&TSG101蛋白检测试剂盒，UR52301”。
16、提取的外泌体进行 Western Blot 前是否需要加入 RIPA 试剂裂解？
需要。
一般按照 1:1 的比例加入强R IPA 试剂，或推荐使用“外泌体蛋白专用裂解液，UR33101”。
17、进行外泌体 Western blot 鉴定时有无内参蛋白可供选择？
暂无。
目前文献中报道有使用Actin， GAPDH作为内参蛋白。
18、进行外泌体鉴定检测时，需要准备多少的初始样品量？
根据Umibio实验室的数据统计，进行不同的鉴定检测实验，建议准备相应剂量的初始样品量：
| 样品类型 | 电镜检测 | NTA检测 | Western blot检测 |
| 肿瘤细胞上清液 | ≥20 mL | ≥20 mL | ≥60 mL |
| 原代细胞/干细胞/神经细胞上清液 | ≥40 mL | ≥40 mL | ≥120 mL |
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