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Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 产品规格 | |
| 10911ES20 (20 T) | 10911ES50(50 T) | ||
| 10911-A | 2×Hieff Clone® Enzyme Premix | 200 μL | 500 μL |
| 10911-B | 500 bp Control Insert (25 ng/μL) | 5 μL | 5 μL |
| 10911-C | pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL | 5 μL |
产品应用
快速克隆；定向克隆；定点突变。运输与保存方式
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。注意事项
1. 需自备的材料：
1）自备样品：自备好线性化载体和插入片段。
2）自备试剂（仅罗列部分）：
① 超级感受态：转化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超级感受态细胞（Cat#11802）；
② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效产品；
③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效产品；
④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效产品；
3）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等；
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途！
实验流程
一. 制备线性化载体
选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。建议尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。载体克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内最佳。线性化载体可通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。
1.酶切制备线性化载体
1）双酶切线性化：线性化完全，转化背景低。建议使用。
2）单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
【注】：不含插入片段的假阳性克隆是由未线性化环状载体转化而形成的。若这种假阳性克隆比例较高，建议重新制备线性化载体。
2.反向PCR扩增制备线性化载体
建议使用高保真聚合酶（如：Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff CloneTM重组反应体系兼容几乎所有酶切反应体系和常规PCR反应体系，当载体酶切产物或反向PCR扩增产物纯度较高时，可以无需纯化，直接进行重组反应。但纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒时，建议使用高质量的试剂盒对线性化载体进行胶回收纯化，以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环状载体，有利于提高重组效率。
二. PCR扩增制备插入片段
1.设计扩增引物
Hieff CloneTM引物设计方式：通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位点）的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。
插入片段正向扩增引物设计方式：
5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列—3’
插入片段反向扩增引物设计方式：
3’—基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（可保留或删除）+下游载体末端同源序列—5’
【注】：①基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
②上游/下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列（用于同源重组），GC含量40%-60%为佳。
推荐使用翊圣无缝克隆引物设计软件（http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自动生成插入片段的扩增引物。若手动设计，可参照以下实例
| 1）如载体选用双酶切线性化（Hind III + EcoR I）： |
|
|
| 2) 如克隆载体选用单酶切线性化（BamH I）：
（注：克隆完成后插入片段两端都具有完整的BamH I酶切位点）
|
| 3）如载体选用反向PCR扩增制备：
（注：克隆完成后插入片段将与载体无缝拼接） |
图2 插入片段引物设计方案
【注】：最终引物长度超过40 bp，建议选用PAGE纯化方式进行引物合成。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克隆，建议Tm≥48℃。
2.插入片段PCR扩增
插入片段扩增可用任意PCR酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入，建议使用高保真聚合酶进行扩增（Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。
PCR扩增结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如果扩增模板不是与载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，则扩增产物可以无需纯化，直接用于重组反应。但PCR扩增产物纯度较低时，建议使用高质量的试剂盒对PCR扩增产物进行胶回收纯化，以提高产物纯度，有利于提高重组效率。
三. 线性化载体与插入片段浓度测定
推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准（DNA Marker）比较条带亮度以确定其近似浓度。
四. 重组反应
1. 线性化载体与插入片段使用量计算
Hieff CloneTM重组反应体系最适载体使用量为0.03 pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适载体使用量 = [0.02×载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段碱基对数]ng (0.09 pmol)
例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的载体时，载体的最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。
【注】： 1）当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。
2）线性化载体的使用量应在50-200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20-200 ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。
3）线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。
2.反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）
| 组分 | 重组反应 | 阴性对照-1 | 阴性对照-2 | 阳性对照 |
| ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
| 2×Hieff Clone Enzyme Premix | 10 μL | 0 μL | 0 μL | 10 μL |
| 线性化载体 | X μL | X μL | 0 μL | 1 μL |
| 插入片段 | Y μL | 0 μL | Y μL | 1 μL |
【注】：1）X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用量。
2）阴性对照-1可用来确认线性化载体有无环状质粒残留，可选择性进行。
3）当插入片段扩增模板是与载体抗性相同的环状质粒时，可用阴性对照-2来确认有无环状质粒模板残留，可选择性进行。
4）试剂盒中提供阳性对照反应所需组分，可用来排除其他实验材料及操作因素的影响，可选择性进行。
3.重组反应
1）体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
2）置于50℃反应20 min。当插入片段＞5 kb时，可将孵育温度延长至25 min。
【注】：建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。
3）待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5 min，以防温度过高降低感受态转化效率。
4）反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
五. 重组产物转化、涂板
1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。
2）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
3）42℃热激90秒，冰浴孵育2 min。
4）加入900 μL SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃，200 rpm，摇菌45 min。
5）5000 rpm离心3 min，弃掉900 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。
六. 克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20-50 μL LB培养基中混匀，直接取1 μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。
应用实例
图3：Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。
A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。
常见问答
1、最佳克隆位点选择？
答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。
2、无克隆长出或克隆数较少？
答：出现该情况，建议同时使用试剂盒所附带的阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：
1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。选择克隆感受态细胞(如DH5α)，不能选择表达感受态细胞。
3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。
4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
3、 出现较多假阳性
答：主要有以下可能情况：
1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。
2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。
3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。
4、菌落PCR无条带
答：主要有以下可能情况：
1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。
2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
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