PDX模型质控检测试剂盒使用说明书(定量PCR法)
 

【产品规格】

PDX50  50T

【产品说明】

人源肿瘤异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft , PDX）是将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立的人源异种移植模型，是癌症机制研究和药物测试的有用工具，但随着传代次数增加，肿瘤组织保真度下降。
本产品试剂盒采用双色荧光探针 qPCR（FAM+HEX）检测PDX模型总DNA中小鼠DNA的比例，并以此推导小鼠细胞浸润比例，检测对象为组织DNA。该试剂盒具有以下特点：
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。                      

1. 可靠：样本与多个内标同板检测，减少孔间干扰。
2. 方便：操作简单，无需电泳步骤。
3. 定量： △CT 值，可定量检测。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输， -20℃保存，有效期 1 年，冻融以后，4℃保存，有效期4周。

【产品组分】

组分名称	PDX50
Biowing®PDX qPCR SuperMix	2,700µL
Standard1	30µL
Standard2	30µL
Standard3	30µL
RNase Free Water	100µL

注：（1）Biowing®PDX qPCR SuperMix含引物与其他PCR成分；（2）Standard包含小鼠DNA和人基因组DNA，Standard1、2和3分别对应小鼠DNA含量为25%、50%和75%；(3)本试剂盒提供试剂，使用前请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，低速离心、小心开启后使用。
【阈值设置】以50%标准品Standard2扩增曲线，设置阈值线，满足下列CT值范围

1. 人DNA扩增曲线CT值定为25±1；

（2）小鼠DNA扩增曲线CT值定为24±1。

【操作步骤】

1. 样品准备

使用商业化DNA抽提试剂盒提取组织DNA，DNA纯度A260/A280≈1.8，建议浓度为20-50ng/µL，上样2µL。
注：样品浓度过高或过低都会影响扩增效率，对实验造成干扰，测量结果误差较大。

1. qPCR反应体系及条件

反应体系以20µL为例

组分/样品管	待测样品管(µL)	阴性对照管(µL)	标准品对照1(µL)	标准品对照2(µL)	标准品对照3(µL)
Biowing®PDX qPCR SuperMix	18	18	18	18	18
RNase Free Water	0	2	0	0	0
Standard1	0	0	2	0	0
Standard2	0	0	0	2	0
Standard3	0	0	0	0	2
Sample	2	0	0	0	0

PCR仪设置以SLAN-96S为例。

步骤		循环数	温度	时间
1	预变性	1	94℃	5 min
2	变性	40	95℃	15 s
	退火		60℃	1 min
	延伸		72℃	30 s
温度选择：72℃延伸时收集荧光信号
通道选择：人细胞检测通道-FAM；鼠细胞检测通道-HEX

【标准曲线】举例 注：建议每批次检测，均绘制标准曲线，三个阳性标准品，分别3次技术重复，绘制散点图并添加线性拟合趋势线，获得回归方程，用于小鼠细胞浸润比例的计算。
【结果判读】 以标准曲线的线性回归方程为：Y=-0.4061*X+0.4089为例
PDX模型中细胞比例计算方法（鼠:人）：根据标准曲线计算PDX样本中的鼠、人细胞比例。
注：标准曲线的线性回归方程为：Y=-0.4061*X+0.4089
相关系数R²：0.9998
X：△Ct值（CT_小鼠-CT_人）
Y：PDX模型中人鼠混样比例（样本比例为小鼠细胞：人细胞）的log10值，即Y=log₁₀(小鼠:人比例)。
小鼠:人比例=power(10,Y)，
小鼠DNA占总 DNA 百分比=power(10,Y)/(1+ power(10,Y))
人DNA占总DNA百分比=1-小鼠DNA占总DNA百分比