小鼠端粒长度检测试剂盒

【产品规格】

1. TL50  50*2*3 Reaction

【产品说明】

端粒（Telomeres）：是真核生物线性染色体末端的非编码串联重复性(TTAGGG)n阵列，端粒长度的变化，与衰老、癌症、或神经退行性等多种疾病相关。定量PCR法是检测端粒长度的经典技术，用时短，操作简单，结果准确，适用于批量样本检测。
本产品试剂盒采用荧光 qPCR（SYBRgreen）检测端粒长度，检测对象为血液、组织DNA或细胞DNA。该试剂盒具有以下特点。

1. 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
2. 方便：操作简单，无需电泳步骤。
3. 相对定量：引入一个端粒长度检测的标准品，用于构建标曲得到拟合方程，可获得样品的相对长度（T/S）。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输， -20℃保存，有效期 6个月，冻融以后，4℃保存，有效期2周。

【产品组分】

组分名称	TL50	储存条件
Biowing®Telomere Detection Mix	1560 ul×2管	-20 ℃，避光
Primer（端粒）	570µL×2管	-20 ℃
Primer（内参）	570µL×2管	-20 ℃
Standard  1	50µL	-20 ℃
RNase Free Water	100µL	-20 ℃
Paraffin oli	1ml	4 ℃

注：本试剂盒提供试剂，使用前请上下轻柔颠倒十次混匀，后低速离心、小心开启。避免起泡。实验时，操作须全程在冰上进行 。Biowing®Telomere Detection Mix 启用后避免反复冻融，使用结束后置于4℃保存，两周内使用完毕。Standard 1是C57幼鼠鼠尾DNA，用于构建标准曲线，端粒具体算法见附录2。

【操作步骤】

1. 样品准备及质控

端粒长度检测与样本质量相关性较大，DNA质量要求较高，如果对一批样本进行检测，若利用不同提取方式或者不同提取试剂盒提取的DNA，以及质量较差的DNA，我们建议对样本DNA进行纯化，保证样本的均一化。纯化的方式本方案采用磁珠分选的方法，具体步骤见附录1。若采用其他纯化方式如乙醇法纯
化、过柱纯化，可自行尝试；纯化后的A260/280及A260/230的比值基本相同，在1.3-2.0之间。
将样本浓度标化至10ng/µL，上样2µL。标准品的DNA浓度标化至20ng/µL，按2倍、4倍、6倍浓度梯度稀释后，上样2µL，用于构建标准曲线（其中端粒通道DNA上样量40ng 、20ng、10ng、5ng；内参通道DNA上样量为40ng 、20ng、10ng）。

1. qPCR反应液的准备

1. 根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本两个基因，分别做3 个重复孔。

端粒反应孔数=（Standard1 × 4 个梯度）× 3 +（ 样本数）× 3
内参反应孔数=（Standard1 × 3 个梯度）× 3 +（ 样本数）× 3

1. 根据反应孔数计算所需的 Mix 总量（含有 1孔的加样损失量）：

Mix（端粒或内参） =（反应孔数+1）× 18μl

1. 各试剂放 2-8℃条件下融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：

端粒通道

组分/样品管	1人份	N人份
Biowing®Telomere Detection Mix	10.4	10.4 N
Primer（端粒）	7.6	7.6N

内参通道

组分/样品管	1人份	N人份
Biowing®Telomere Detection Mix	10.4	10.4 N
Primer（内参）	7.6	7.6N

 

1. 加样

（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装 18μL qPCR Mix。
（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入10ul石蜡油。
（4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：

PCR模板	qPCR Mix	总体积
样本（模板上样量40ng） 2 μL	18 μL	20 μL
Standard 1（模板上样量40ng）2 μL	18 μL	20 μL
Standard 1（模板上样量20ng）2 μL	18 μL	20 μL
Standard 1（模板上样量10ng）2 μL	18 μL	20 μL
Standard 1（模板上样量5ng）2 μL	18 μL	20 μL

注：盖上八联管盖或者光学膜后盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底；充分震荡混匀后，再短时低速离心，将管盖和管壁的残留液体收集至底，如有气泡，需将气泡排尽。

PCR仪设置以 宏石SLAN 96S 为例，其他型号定量PCR仪应通过标准品进行参数校正或咨询专业技术人员。

步骤		循环数	温度	时间
1	预变性	1	95℃	5 min
2	变性	35	95℃	15 s
	退火		58℃	1 min
	延伸		72℃	30 s
温度选择：72℃延伸阶段 时收集荧光信号
通道选择：样本检测通道-SYBRgreen

【阈值设置】

1. 以宏石SLAN-96S为例，扩增曲线算法选择绝对荧光值法，基线设置在2-7个循环
2. 阈值设定：以标准品CT值设置内参和端粒扩增曲线阈值，将内参的CT值定为 25±1，将端粒的CT值定为 9-12 。阈值的设定要保证样本及标准品的3重复的△CT在0.3以内。
3. 阈值设置以后，如下图所示，标准曲线个的浓度梯度之间呈现较好的CT差异，端粒通道和内参通道的△CT均在 1 左右。                                 

说明：

1. 根据标准品标准曲线 ， 若最后一个浓度梯度的CT值过大，表明试剂盒扩增效率下降或仪器运行障碍。
2. 调整阈值线后，标准品的几个浓度梯度之间的△CT相差过大，说明操作有误。

备注：
端粒长度计算方法见附录2

附录 1

磁珠法纯化DNA参考步骤
使用英莱盾 LD102-060 DNA 片段筛选功能磁珠试剂盒，在纯化DNA的同时可以去除不良样本中因降解产生的小片段DNA。磁珠上样量已经经过摸索在保证得率的情况下，去除小片段。
准备工作：
将磁珠由 2-8℃中取出，室温平衡至少 30min，配制 80%乙醇。
Step1 涡旋震荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
Step2 结合（吸附目的片段）
1. 取样本DNA（建议DNA总量>500ng，体积>20μL）,向样本DNA中加入0.6倍样本DNA体积的磁珠，使用移液器小心吹打 10 次；
2. 室温静置 5min；
3. 室温 12000rpm 离心 30s（该步骤可以加速聚集磁珠，可选）；
4. 将离心管置于磁力架上至溶液完全澄清（约 1min），弃去上清。
Step3 清洗
保持离心管固定于磁力架上，加入  80%乙醇（加入的体积视情况而定，若在1.5ml离心管中纯化加入200μL，在200μL离心管中纯化加入100μL），静置 1min，无需重悬磁珠，弃去上清（保持离心管固定于磁力架上）；重复该操作一次。
Step4 除醇
保持离心管置于磁力架上，静置通风 2-5min 除醇。
注：除醇过程中请勿过分干燥磁珠，否则会降低纯化效率。
Step5 洗脱
1. 将离心管从磁力架上取下，加入 30μL 洗脱液（建议使用TE，水洗脱可能会降低纯化效率）洗脱，使用移液器小心吹打 10 次；
2. 室温静置 5min；
3. 室温 12000rpm 离心 30s（该步骤可以加速聚集磁珠，可选）；
4. 将离心管置于磁力架上至溶液完全澄清（约 1min），待磁珠完全吸附后将上清转移至新样品管中备用。

附录 2
结果与计算 

1. 标准曲线的构建

以标准品3个或4个浓度梯度下的平均CT值为横坐标，log₂浓度为纵坐标，构建标准曲线

端粒通道CT值	12.22	11.233	10.447	9.473
Log2浓度	2.321928095	3.321928095	4.321928095	5.321928095

 

内参通道CT值	25.363	24.513	23.22
Log2浓度	3.321928095	4.321928095	5.321928095

                       

1. 利用标准曲线计算样本的T/S

将样本的端粒和内参通道的CT值代入标准曲线方程，即可得到样本的T/S
下图为两个小鼠组织样本（2月龄、24月龄）的计算示例
 

样本	端粒ct值	内参ct值
2月龄	10.327	24.417
24月龄	11.277	24.545
标曲拟合方程	y=-1.1057x+15.812	y=-0.9435x+27.801
带入公式
2月龄	4.3934361	4.7635605
T/S		0.9223
24月龄	3.3430211	4.6427925
T/S		0.72