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Human残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）说明书
货号： HG-HD001
产品简介：
Huamn残留DNA检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品中间品、半成品及成品中Human宿主DNA的专用试剂盒，本试剂盒利用Taqman探针原理，定量检测样本中Human残留DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可达到fg水平。
配套样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）进行样品的前处理。
试剂盒配套Human DNA定量参考品为国家标准品。
检测范围：3×101 fg/μL~3×105 fg/μL
规格：
100 Reactions
产品组成：
| 组分 | 规格 | 存储条件 |
|---|---|---|
| Human DNA定量参考品（30ng/μL） | 50μL×1 管 | -20℃ |
| Human Primer&Probe MIX | 550μL×1管 | -20℃ |
| 2×qPCR Reaction Buffer | 1.2mL×1 管 | -20℃ |
| DNA稀释液 | 1.5mL×3 管 | -20℃ |
| ROX High | 50μL×1 管 | -20℃ |
| ROX Low | 50μL×1管 | -20℃ |
产品储存条件与有限期：
存储条件见上表，有效期18个月。
需要准备的耗材与设备
实验前请准备好下列耗材与设备：
◆1.5mL或2mL无菌低吸附离心管
◆ 与PCR仪适配的96孔qPCR板或八联排管
◆ 1000μL，200μL，10μL无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 荧光定量PCR仪
◆ 水浴锅/金属浴
◆ 离心机
◆ 震荡器
◆ 各规格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
实验步骤
一、 样品前处理
详见我司样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）操作说明书。
二、 qPCR操作步骤
1. 定量参考品及NCS、NTC的制备
◆ 离心机
◆ 震荡器
◆ 各规格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
实验步骤：
一、 样品前处理
详见我司样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）操作说明书。
| 组分名称 | 单反应用量（μL） |
|---|---|
| DNase I | 1 |
| 10X Reaction Buffer with MgCl2 | 2 |
| RNase Inhibitor | 0.5 |
| 无酶去离子水 | 12.5 |
| 供试品 | 4 |
二、 qPCR操作步骤
1. 定量参考品及NCS、NTC的制备
1.1 定量参考品：取出Human DNA定量参考品、DNA稀释液置于冰上融化；待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心；
1.2 取 6 支干净的1.5mL离心管，分别标记为ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；
1.3 标准品稀释过程如下表
| 标准品代号 | 稀释体积 | 浓度(fg/μL) |
| ST0 | 10μL Human DNA 定量参考品 + 90μL DNA稀释液 | 3 × 106 |
| ST1 | 10μL ST0 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 105 |
| ST2 | 10μL ST1 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 104 |
| ST3 | 10μL ST2 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 103 |
| ST4 | 10μL ST3 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 102 |
| ST5 | 10μL ST4 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 101 |
1.4 NCS 的制备：取100μL DNA稀释液与样品同时进行前处理，纯化洗脱后的产物即为NCS。
1.5 NTC 的制备：100uL DNA稀释液；
1.6 加标回收ERC：建议90uL样品+10uL ST3，也可根据实际情况按照其他方式制备。
2. q-PCR 反应液的制备和加样
2.1 根据所需检测的标准样品和待测样品数量（一般做 3 个复孔），计算所需孔数：
反应孔数 =（5 个浓度梯度的标曲 +2 个阴性对照 NTC 和 NCS+ 待测样品）×3
2.2 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR Mix 总量：
qPCR Mix=（反应孔数 +2 或 3）× 15μL（2 或 3 为操作损失量）
2.3 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示配制 qPCR Mix。
| 组分 | 单孔反应(μL) |
| 2x qPCR Reaction Buffer | 10 |
| Human Primer&Probe Mix | 4.6 |
| ROX* | 0.4 |
| 总体积 | 15 |
qPCR Mix配制表
*请对应机型选择适配的ROX；若机型适配为no ROX，请加入等体积的去离子水（要求无核酸及核酸酶污染）。
3. 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示加样（总体积20μL）：
| 参考品 | 15μL qPCR Mix +5μL ST1/2/3/4/5 |
| 阴性对照 | 15μL qPCR Mix +5μL NTC/NCS |
| 待测样品 | 15μL qPCR Mix +5μL待测样本 |
各反应孔加样示例
4.实验需使用qPCR实验专用的八联管或者96孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心将液体离至管底准备反应。
5.反应孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | |||||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
三、 qPCR反应程序和参数设置
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例。）
1.创建实验反应程序，设置两步法反应程序如下表：
| Stagel | 预变性 | Reps:1 | 95℃ | 2min |
| Stage2 | 循环反应 | Reps:40 | 95℃ | 15s |
| 60℃ | 30s |
2.创建实验反应板，点击Select Fluorophores选择荧光FAM；在反应板图表中，选择样品孔，在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为Human-DNA；输入每个样品的重复次数及Sample Name；
3.在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为Human-DNA；输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。分别在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5的Concentration一栏赋值为3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01（单位为fg/μL）；
4.点击Run界面“Start Run”按钮进行PCR测定。
四、 qPCR结果分析
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例
1. 点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、扩增效率（Effect）、R2。
2. 在视窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一栏可读取无模板对照NTC、NCS、待测样本的检测值，单位为fg/μL。
3. 数据可靠性评估：
• 三个平行孔间Ct值差应小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 阴性对照NTC和NCS的CT值都应大于标曲最低浓度的CT值或根据实验室自身验证结果设定标准；
• 标准曲线线性相关系数R2≥0.98，扩增效率85%~110%之间；
• ERC回收率在50%~150%之间（加标回收率=ERC/(0.9*样品+0.1*ST3)。
注意事项：
1. 本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴
好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测，以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，
预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。
