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E.coli 残留总RNA检测试剂盒 (RT-PCR荧光探针法) 说明书
货号：HG-ER001
产品简介：
E.coli 残留总RNA试剂盒用于定量检测各种生物制品中大肠杆菌总RNA的残留情况，辅助进行生物制品的核酸质控。本试剂盒使用RT-PCR荧光探针法原理，将反转录和荧光探针qPCR检测技术融合，可实现一步法定量检测。通过在大肠杆菌含量高、表达稳定的RNA靶标上，设计特异性引物和探针，通过绝对定量的方法测定总RNA残留。
规格：
100 Reactions
产品组成：
| 组分 | 管数 | 体积 | 存储条件 |
|---|---|---|---|
| One Step RT-qPCR buffer | 1 | 1mL | -20℃ |
| One Step Enzyme Mix | 1 | 100μL | -20℃ |
| E.coli RNA Primer& Probe Mix | 1 | 370μL | -20℃ |
| E.coli RNA定量标准品（2ng/μL） | 1 | 25μL | -20℃ |
| RNA IPC Primer&Probe Mix | 1 | 370μL | -20℃ |
| ROX High | 1 | 50μL | -20℃ |
| ROX Low | 1 | 50μL | -20℃ |
| RNA稀释液 | 2 | 1mL | -20℃ |
产品储存条件与有限期：
所有试剂都于-20℃避光保存与运输，有效期18个月
实验步骤：
一、 样品前处理（需使用试剂盒：HG-CL300）
1.样品中大肠杆菌（E.coli）RNA残留检测作为残留类的检测项目，检测前需要去除供试品中的DNA，因此需要对供试品进行样本前处理。可选择使用我司配套的样本前处理试剂盒，处理方式如下 ：
| 组分名称 | 单反应用量（μL） |
|---|---|
| DNase I | 1 |
| 10X Reaction Buffer with MgCl2 | 2 |
| RNase Inhibitor | 0.5 |
| 无酶去离子水 | 12.5 |
| 供试品 | 4 |
2. 按照上表方式配置供试品 DNaseI 消化液，震荡混匀，离心 5s；
3. 将配置完成的供试品 DNaseI 消化液置于 37℃恒温水浴锅中孵育 60min；
4. 取出孵育后供试品 DNaseI 消化液，瞬时离心 5s 后置于 65℃干式恒温器中孵育 10min 灭活 DNase I 酶，将灭活后的供试品DNaseI 消化液放置于 2-8℃冰箱暂存。
二、 qPCR操作步骤
1.定量参考品及NTC制备
1.1 将试剂盒中的大肠杆菌RNA定量标准品和RNA稀释液置于冰上，待完全融化后，轻微振荡混匀，短暂离心将液体甩至管底；
1.2 取6支干净的1.5mL离心管，分别标记为ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；
1.3按下表进行标准品的梯度稀释，每次稀释确保充分混匀后再进行下一个梯度的稀释。（表格中的体积仅供参考，可根据实际实验需求等比例扩大）；
| 稀释管 | 稀释体积 | 浓度(fg/μL) |
| ST0 | 5 μL定量参考品+ 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+05 |
| ST1 | 5 μL ST0 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+04 |
| ST2 | 5 μL ST1 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+03 |
| ST3 | 5 μL ST2 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+02 |
| ST4 | 5 μL ST3 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+01 |
| ST5 | 5 μL ST4 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+00 |
1.4 NTC 的制备：100uL RNA 稀释液。
2.RT-qPCR反应液的制备和加样
2.1 从冰箱里取出各试剂置于冰上解冻；
2.2 PCR反应液配制：详见表5，One Step RT-qPCR buffer、One Step Enzyme Mix、E.coli RNA Primer& Probe Mix、ROX，这4种试剂可提前预混成Mix, 再依次加入5μL标曲 (ST1/ST2/ST3/ST4/ST5)、NTC、供试品溶液，混匀。每个样各做三个平行。
2.3 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：
Mix混合液 =（反应孔数+2）× (10+1+3.6+0.4) μL（含有2孔的损失量）
加样完成密封好管子后，请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
| 组分 | 单孔反应(μL) | 备注 |
| One Step RT-qPCR buffer | 10 | 可以提前预混Mix,每孔加 15μL mix再对应加5μL标曲/ NTC/样品 |
| One Step Enzyme Mix | 1 | |
| E.coli RNA Primer&Probe Mix | 3.6 | |
| ROX | 0.4 | |
| 标曲/NTC/样品 | 5 | |
| 总体积 | 20 |
RT-qPCR反应液配制表
*请对应机型选择适配的ROX；若机型适配为no ROX，请加入等体积的去离子水（要求无核酸及核酸酶污染级去离子水）。
3. IPC组配制反应液的制备和加样（如果在检测中已经有如加标回收等方式，IPC检测可以取消）每次实验需做一个无模板对照（IPC-NTC）和各个待测样本的IPC（IPC-S）检测，根据下表：
| 组分 | 单孔反应(μL) | 备注 |
| One Step RT-qPCR buffer | 10 | 可以提前预混Mix，每孔加 15μL mix 再对应加5μL IPC-样 品 / IPC-NTC |
| One Step Enzyme Mix | 1 | |
| RNA IPC Primer&Probe Mix | 3.6 | |
| ROX | 0.4 | |
| IPC-NTC / IPC-样品 | 5 | |
| 总体积 | 20 |
IPC RT-qPCR反应液配制表
备注：
加标体系ERC：90μL 样品+10μL ST3；
加标回收率=ERC/（0.9*样品+0.1*ST3）；（加标回收率质控标准：50%~150%）
加标回收与IPC二选一，如选择加标回收，可将表7中IPC-S更换为ERC-S。
4.反应孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | IPC-S1 | IPC-S1 | IPC-S1 | |||||||||
| G | NTC | NTC | NTC | IPC-S2 | IPC-S2 | IPC-S2 | ||||||
| H | IPC-NTC | IPC-NTC | IPC-NTC | IPC-S3 | IPC-S3 | IPC-S3 |
备注：该示例表示的是检测5个浓度梯度的RNA标准曲线、1个无模板对照NTC、3个待测样本。针对IPC的无模板对照（IPC-NTC）和待测样本的 IPC（IPC-S1，IPC-S2，IPC-S3）。每个检测做3个重复孔。实际检测时可根据样本多少，参照上表示例进行96孔板排版加样。
加样完成后将96孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，用96孔板专用离心机短暂离心将液体全部甩至管底后放入qPCR仪中。
三、 反应程序和参数设置
（以ABI公司7500 qPCR仪，软件版本V2.0.6为例）
1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板，taqman探针法。
2.创建新检测探针，命名为E.coli RNA，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为none；创建新检测探针，命名为RNA IPC，选择报告荧光基团为VIC，猝灭荧光基团为none；检测参比荧光为 ROX。
3.设置三步法反应程序如下表：反应体积 20μL。
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃ | 15min | 1 |
| 预变性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10sec | 45 |
| 退火/延伸(收集荧光) | 60℃ | 40 sec |
反应程序
4. 运行PCR程序。
四、 结果分析
1. 在Results 的Amplification Plot 中，可初步查看扩增曲线的形态是否正常。机器通常会自动设置阈值（Threshold ）和基线（Baseline），当target设置等不同时可能会出现多个阈值，而导致结果分析有误，此时请手动设置阈值线，但需确保设置的阈值线在指数扩增区，如通常Threshold设置为0.15，选Auto Baseline，点击Analyze，可看到调整后的结果。
2. 在Results的Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。 可接受标准Effective：85%~110%，R2≥0.98；
3. 在Results 的Report中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、待测样本的检测值，单位为fg/μL。NTC的Ct值应大于ST5的Ct值，检测值应低2fg/μL。
4. 分析IPC的Ct值，正常情况下样本的Ct-IPC值应该与无模板对照NTC的Ct-IPC值一致或±2。如样本的Ct-IPC值与无模板对照NTC的Ct-IPC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。
5. E.coli RNA 残留量计算：
异常数据及检测过程出现意外情况比如管漏液，样本蒸发以及样本加错等，其产生的数据应删除，并在检测记录中说明原因，其他正常的数据可以继续应用于检测结果的计算中
注意事项：
1. 本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴
好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测，以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，
预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。
