【产品规格及货号】

HRAP-50；50反应/盒

【产品优势】

方便：操作简单，可直扩检测。

灵敏：微量核酸即可检测。

特异性：不与其他类似物产生交叉反应。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输，-20℃保存，其中保存液和裂解液4℃保存，反复冻融次数低于3次，有效期 1年。

【自备仪器】

SLAN96或其他四色荧光定量PCR仪、离心机。

【产品组分】

A:

B:

    

注：若采用直扩法需自行采购保存液和裂解液（货号：CL-50）

 

【操作步骤】

1. 试剂的复溶：

检测液和阳性质控先12000 rpm离心5 min，再分别用75 μL/管和50 μL/管 RNase Free Water复溶，混匀1min，再瞬离。

2. 样本制备（自备）

A 样本的标准制备方案：请使用高效DNA 提取试剂盒提取人口腔黏膜、全血或新鲜组织样本的DNA。推荐使用无微生物污染级别的核酸提取试剂盒。

 

B 样本的简易快速制备方案：可用于人口腔拭子，样本制备步骤如下。

（1）采集口腔拭子（1根），存放于口腔拭子保存液中。保存液存放于1.5 mL EP管中，管内含0.5 mL保存液。

（2）将含拭子的保存液EP管震荡20 s，然后低速(2000 rpm)瞬离（5 s），将管盖上的液体离心下去。

（3）打开盖子，枪头插到底部，吸取50 μL溶液。转移到200 μL的EP管中。

（4）将上述200 μL EP管中加入5 μL裂解液，吹打混匀10次。

（5）将EP管上PCR仪，95 ℃10 min。

（3）2000 rpm离心2分钟，将各类细胞碎片离心到管底。打开盖子，取4 μL上清作为模板(在液面取样，吸头不要插到管底)，加入PCR体系。

 

1. qPCR 反应液的准备

（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做单复孔。

反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+样本数

（2）根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：

Mix =（反应孔数+1）×16 μL

（3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：

表2 qPCR Mix的配制

 qPCR 反应体系及条件（反应体系以20 µL为例）：

加样

（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

（2）向每孔反应管中分装 16 μL qPCR Mix。

（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 μL石蜡油。

（4）向反应管中穿过石蜡油层加样，3000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：

表 3 加样示例

PCR 仪设置以 SLAN96为例，溶解曲线模式，通道选择FAM和ROX：

 【结果判读】三个位点的基因型判读如下所示：

注：阴性对照应无熔解峰；温度偏离峰±1℃属正常现象。

                         

                          

 

【参考文献】

［1］李京等.ApoE 基因多态性与中国人群 MS 相关性 Meta 分析［J］中国公共卫生，2013.29(9):1336-1340

［2］沙海滨，贺圣文． 痛风相关因素及其易感基因研究进展［J］.中国公共卫生，2009,25（5）:629-631

［3］Zannis VI，Breslow JL，Sangialomo TR. Characterization of the major apolipoproteins secreted by two human hepatoma cell lines ［J］.Biochemistry，1981，20( 25) : 7089-7096．