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产品名称：2×SYBR Green qPCR 试剂（预混 ROX2型）
产品用途：适用于实时荧光定量 PCR（qPCR）的反应试剂，适用需要 low ROX 校准的仪器，如 ABI 7500，Bio-Rad iQ5 等。
产品描述：
本试剂盒采用具有超强扩增能力和抗干扰能力的热启动DNA聚合酶，结合其高度优化的缓冲液体系和染料系统，使之具备了更强的扩增效率、抗干扰能力及更高的灵敏度和特异性。在相同的情况下具有起峰更早、得到的荧光信号更强、Ct值更小及熔解曲线特异性更高等特点。此外，为了进一步简化操作，本试剂盒的2×SYBR Green qPCR Master Mix预混了ROX2染料（low ROX），从而只需要将模板cDNA、引物以及ddH2O添加进去，即可进行qPCR反应。
产品组成：
组分名称 | UR32080 | UR32081 |
2×SYBR Green qPCR Master Mix(ROX2)* | 1 mL | 5 mL |
*包含热启动DNA聚合酶, dNTPs, Mg2+, buffer, 和 SYBR Green I染料，预混了低浓度ROX(ROX2)用于校正不同孔之间的荧光信号误差。
产品优势：
专注于外泌体提取和配套试剂盒研发；
性价比高，为您的研究开展节省成本；
数百篇参考文献让您放心使用无忧购；
适用的仪器型号：
ABI 7500, 7500 Fast, Quant-Studio 3, 5, 6, 7, 12K Flex, Dx, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3000P™, MX3005P™等
无需ROX校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™,Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Roche LightCyclerTM 96, Roche LightCyclerTM 480; Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000; Thermo Scientific PikoReal Cycler; Analytikjena qTOWER 3G; Cepheid SmartCycler®等
（如果仪器不在下表中，请选用UR32071：2×SYBR Green qPCR试剂（预混ROX1型））
质控数据：
产品使用：
1、 使用前，将2×SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)试剂从-20℃冰箱中取出，室温放置5~10 min或用手紧握试剂管使之充分融化，上下颠倒5~10次充分混匀（非常重要），然后使用离心机短暂离心至管底，放在冰上备用。
2、 逆转录反应得到的cDNA建议稀释并充分混匀后再作为模板使用，这样可以提高实验的重复性。通常建议稀释5~10倍后再使用（具体的稀释倍数根据基因表达丰度来确定）。在20 μL的qPCR反应体系中如果模板cDNA稀释10倍，建议使用4 μL的cDNA（2~8 μL），按照如下表格进行qPCR反应体系的配制：
3、 qPCR加样体系的配制：为了使加样误差降低到最低，一般建议将cDNA和ddH2O配制成预混液，2×SYBR Green qPCR Master Mix和引物对配制成预混液，分别混匀后再依次加入到每个反应孔中（例如，对于20 μL的qPCR反应体系：每个反应孔中，cDNA和ddH2O的预混液加4 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix和引物对的预混液加16 μL）；或者根据个人熟练掌握的加样方式进行加样。
4、 加样完成后，盖上封板膜封紧，然后用离心机1000 rpm离心1 min，将液体离心至qPCR孔板底部。
5、 qPCR反应程序如下：
Step | 1 | 2 | |
热启动酶活化*1 | PCR反应(循环数40 cycles) | ||
解链 | 退火&延伸 （采集荧光信号）*2 | ||
温度 | 95℃ | 95℃ | 60℃ |
时间 | 5 min | 10 sec | 30 sec |
*1：95℃反应5 min的目的是活化热启动酶，该步骤为必须步骤，因此不能省略；
*2：在退火&延伸这一步骤需要进行荧光信号的采集。
上述反应程序设置好后，按照仪器默认的程序添加熔解曲线。
下方表格提供了一种代表性的熔解曲线程序供参考：
Step | 1 | 2 | 3 |
升降温速度 | 100% | 100% | 1% |
温度 | 95℃ | 60℃ | 95℃ |
时间 | 15 sec | 1 min | 30 sec |
采集数据 | - | - | 采集荧光信号 |
关于qPCR反应是否良好的判断：
1、 如果扩增曲线呈典型的S型曲线，荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段及平台期均完整可见，熔解曲线单峰，内参Ct值在合理范围内（通常可在13~22之间，典型的内参Ct值在15~20之间），则可认为该反应正常；
2、 同一个模板和引物的重复孔数据Ct值相差0.5以内；
3、 同时满足以上两个条件的可以认为数据可用。
常见的注意事项、操作要点及优化方法：
1、 实验开始前首先验证引物是否适用，标准与上述标准类似，主要观察扩增曲线与熔解曲线；
2、 引物验证好用后应分装几份并放在-20℃保存，以防止污染或降解；
3、 RNA及cDNA的质量均对qPCR的结果具有很大的影响，因此应尽量保证RNA不降解。 RNA提取后应尽快进行逆转录，且避免反复冻融。如果预计使用量较大，则可以一次多逆转录几管cDNA。如果不立即使用cDNA，则建议保存在-80℃冰箱。
经典案例：
