游离胆固醇（FC）含量检测试剂盒 微量法

游离胆固醇(FC)是构成细胞膜的主要成分，也是合成性激素、胆汁酸、维生素D和肾上腺皮质激素等物质的重要原料，FC浓度可作为脂代谢的指标。本试剂盒的检测方法是微量法，既可以用可见分光光度计检测，也可以用酶标仪检测。该产品的最低检出限是0.119 μmol/mL，线性范围为0.125-6 μmol/mL。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-胆甾烯酮和H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，其在500 nm有吸收峰，颜色深浅与FC含量成正比。作用方式如下：

测定总胆固醇(TC)请选择60723ES 总胆固醇(TC)含量检测试剂盒；测定游离胆固醇(FC)请选择60724ES 游离胆固醇(FC)含量检测试剂盒。
 
产品信息

货号	60724ES60
规格	100 T

 
组分信息

组分编号	组分名称	规格	储存条件
60724-A	工作液	20 mL	2~8℃
60724-B	标准品	10 mg	2~8℃

 
储存条件
2~8℃保存，有效期6个月。
 
使用说明
 
【注意事项】实验之前建议选择3个预期差异大的样本做预实验，如果样本吸光值不在测量范围内，建议稀释或者增加样本量进行检测。

1. 需自备的仪器和溶剂：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、EP管、蒸馏水和异丙醇。

1. 溶液的配制：

1）自备提取液异丙醇：大约需要110 mL，常温保存；试剂盒内提供一个30 mL棕色空瓶，仅做分装使用。
2）标准品溶液的配置：10 mg胆固醇使用前加入517 μL提取液，振荡溶解后即为50 μmol/mL的胆固醇标准溶液，2~8℃可保存4周。
3）标准溶液的稀释：取50 μmol/mL胆固醇标准液20 μL ，加入480 μL异丙醇，充分混匀，配制成2 μmol/mL的标准液。注意2 μmol/mL标准液最好现配现用，实验中每管需10 μL，但为减小实验误差，故配制体积偏大。
3. 操作步骤
1）样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
a. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。8000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。
b. 细菌/细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300 w，超声2秒，间隔3秒，总时间3 min）；然后 8000 g，4℃离心10 min， 取上清置于冰上待测。
c. 血清（浆）等液体样本：直接测定，若有沉淀请离心后取上清待测。
2）测定步骤
a. 可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至500 nm，分光光度计蒸馏水调零。
b. 按需取出一定量的工作液，37℃水浴预热30 min。
c. 在1.5 mL EP管/96孔板按下表步骤加样

试剂名称（µL）	测定管	标准管	空白管
异丙醇	10	-	-
标准液	-	10	-
待测上清	-	-	10
工作液	190	190	190
充分混匀，室温静置15 min，反应完成后测定500 nm处吸光值A，分别记为A测定、A标准和A空白，ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准管只需测1-2个。注：若样本为血清，则空白管中的提取液（异丙醇）需要更换为蒸馏水进行实验。

1. 总胆固醇含量计算

a. 血清（浆）中 FC 含量计算：
FC含量（μmol/dL）=C标准液×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）×100=200×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）
b. 组织或细胞、细菌中 FC 含量计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：FC含量（μmol/mg prot）=C标准液×（A测定-A空白）÷（A标准-A 空白）×V样总÷（Cpr×V样总）=2×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）÷Cpr
（2）按样本质量计算：FC 含量（μmol/g 质量）=C 标准液×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）×V样总÷W=2×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）÷W
（3）按细胞/细菌数量计算：FC 含量(μmol/10⁴ cell）=C 标准液×(A测定-A空白）÷（A标准-A空白）×V样总÷N=（A测定-A 空白）÷（A标准-A空白）
C 标准液：标准液的浓度，2 μmol/mL；V 样总：加入提取液的体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；100：单位换算系数，1 dL=100 mL；500：细菌或细胞数量，500万；N：细胞数量，以万计。
4. 实验实例：
取 0.1 g 大鼠肝脏加入 1 mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用 96孔板测得A空白=0.046、A标准=0.354、A测定=0.127，按样本质量计算含量得：
FC含量（μmol/g 质量）=2×（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）÷W =5.320 μmol/g 质量。
 
注意事项

1. 如果样本吸光值大于1.2，建议将样本用提取液稀释后进行测定。
2. 提取液中含有使蛋白变形的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20240122