转染试剂

转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。


影响转染效率因素众多、细胞本身质量、各类细胞特性（这点我们优势很大，常年统计难养细胞问题）、转染试剂选择类型、质粒质量、转染方法、等。本品开发目的就是针对较难转染细胞开发，免疫类细胞、原代细胞、或对转染后荧光，病毒等表达时间要求较长或病毒滴度要求高及上清收获的方案开发，前期预实验建议从293类好转染细胞预实验后，在开始目的难转细胞。先对试剂特性有所了解后。在做293类细胞，本品可六天长时间荧光表达或病毒作用及上清收获蛋白。（辅助有促贴壁试剂，与转染前细胞状态调整，消化要求等建议参考，注明实验室用户，可发细胞图片，我们免费评价参考，深入沟通的用户，可注明细胞来源，试剂厂家，某些习惯操作手法也是大家谈论同一细胞形态差别大我司统计认为观点，我们给您建议与参考，我司有对各类难养细胞常年统计细节的习惯。质粒提取盒子，我们有推荐，越贵越好）

筛选稳定表达株，要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。

可讨论
细胞培养注意事项
转染过程中血清用量
质粒提取用小牌子的，后续污染去除。
启动子：诱导型组成型,质粒的大小和质量,免疫类细胞、原代类细胞、娇贵的细胞，体内DNA疫苗推荐 Qiagen的Endofree系列，不建议用那些快速提取去内毒素的盒子，除非很熟练。
转染RNA：RNA容易降解和防止RNAse污染，采用优质无RNAse污染的血清至关重要。转染复合物和细胞共同孵育的时间越长需求的可考虑我们促贴壁方案。

对照组参比：对于检查问题是非常有用的


转染效率低参考：
转染试剂不适合
转染试剂和核酸或者蛋白的量不够，或者比例不对
基因表达时间有问题：转染后毒性大小问题，扩大或缩小孵育时间
副作用目的基因的毒性
核酸或者蛋白质量问题
报告基因或者检测系统的问题


细胞死亡率高：
过量的转染试剂或者转染复合物
细胞问题
目的基因毒性


转染效率重复性差：
细胞汇合度不同
支原体污染
细胞传代次数

全部进口试剂耗材，国产试剂耗材的暂不在讨论范围内
耐药株筛选方法以开始预实验阶段，欢迎与各位老师讨论。核心是我司促贴壁与噬斑实验（单克隆株筛选）结合使用，筛选过程方便简单。筛选后的冻存复苏，促贴壁试剂起到关键作用。

案例细胞：293FT 
这个细胞好养，养好和不容易
这个首先是THERMO慢病毒腺病毒生产细胞
特点：易成团，上述胰酶方法解决
对碳酸氢钠浓度及培养箱中 CO2 浓度要求高，
一般实验室的293，HELA都是个头小，都是平时习惯造成的。吹打过重，国内库或ATCC来源个头都很大。一般实验室引进后，不好的试剂与不良操作手法，开始培养会出现黑点情况，这也是不良习惯引起细胞变小开始源头。
细胞个头大，状态好。接触质粒与转染试剂面积也大，所以转染效果要好。
细胞个头要小，反正依然
按我上述，复苏细胞应该没有死的，第二天就会长满。
个头要变小了或有黑点，就是吹打造成的，(这里给国内库培养做个说明，国内库培养这类好养细胞，也是保钟级别的试剂与耗材，新购细胞往往会出现这类问题，上述可解决这类问题，前提是试剂耗材都得标准统计）

相关参考
细胞转染前状态调整参考：
胰酶： 
  胰酶统计了六年，推出我们的Optimized Trypsin（下面有产品链接），对胰酶挑剔的细胞有易成团的神经胶质类、肝类、乳腺癌类、胰岛胰腺类、免疫悬浮（这个成团也可通过离心后，加入低浓度胰酶解决团聚）团聚问题
不解决，冻存后的细胞团DMSO深入不充分，容易有冰晶形成损伤细胞，导致复苏后状态不理想，成团成片细胞培养过程中中间细胞得不到完全培养基营养吸收。通过反复多家实验室验证，这点可用我们推荐胰酶，常温消化，完全利用化学作用，无机械力消化成单个细胞，按我们方法与0.25浓度胰酶消化后，吹打散细胞方法冻存后复苏比较细胞成活率，这个成活率高低，也是转染率高低理由。
https://www.biomart.cn/infosupply/79438956.htm   Optimized Trypsin

促贴壁试剂：
转染过程中，对容易漂的细胞一个很好的解决方案
免疫荧光中应用，细胞更舒展，细胞器件清晰可见。
特别是感染细胞生产病毒过程中，细胞与病毒作用时间长，病毒滴度高等优点，
平时培养过程中使用，细胞着床快，明显优于不使用促贴壁培养方法，按理细胞目前有上百代生产应用，链接里有相关案例介绍，与救助珍贵细胞。
耐药株筛选问题：加药后，细胞容易受损伤，易漂，就算做成耐药株后，冻存复苏后容易丢失（活率低，细胞不着床导致）
https://www.biomart.cn/infosupply/49129998.htm   增强型贴壁试剂试验说明书链接

我们建议胰酶工作方法，用上细胞就会有改善。
加促贴壁后，促进细胞着床，生长状态好，质量好。
关于细胞质量，我们用营养极限法验证，不同来源同名细胞，1%FBS,最长时间培养，生存时间最长的，我们判定是质量最好，这个浓度血清方案，在感染病毒中建议用下，感染及转染细胞密度推荐细胞密度较满时候做。
Optimized Trypsin消化时间：3-5分钟（去完全培养基干净）促贴壁试剂加后，20-25分钟。这个参数也是促贴壁力度参考值。
以上案例应用不只是293FT这只细胞，后面列出难养类细胞应用简单说明。

延展应用可讨论：
电转仪转染细胞中，我们转染试剂可做电转液，理论上验证可行，有准备上手的老师可来信讨论。
国内库难养细胞系：beas-2b  HK-2  INS-1 THLE-3这里不做说明，可来信沟通细节
单克隆筛选细胞流感病毒噬斑实验套装（各类单细胞筛选应用与技术沟通后推荐）https://www.biomart.cn/infosupply/89408280.htm

20210630 工程用大体积培养转染及免疫细胞转染，效果完全覆盖PEI转染效果（PEI起始转染细胞量较少，是与我们转染产品较大差别，转染方法可讨论），原代鸡胚、食管正常细胞转染效果优于同类任意厂家（转染前后细胞培养可深入讨论），有做核酸免疫动物用户，原代转染验证我们可发试用，转染前后细胞调整都可讨论。为提高沟通效率，建议发我们可分享部分的POTOCOL及遇到的问题描述，-以上沟通限定进口试剂耗材。正规细胞库老师要有时间测试，我们全程免费测试，无数量限制，


20210730案例：正常组织食管细胞系，无血清方案培养（培养特点无血清容错率差）对转染试剂毒性要求高，我们案例转染后死细胞10%转染效率5% （转染条件未经优化，常规转染）

20210910：正常组织细胞系HUVEC-武汉库来源，转染RNA  国产试剂培养体系，初次常规转染5% （判断其他厂家应该没有转染效果，）经优化RNA梯度后，转染效率40% 细胞漂的多（也可以说是死细胞）
技术意见：转染效率太高，建议用户重购新细胞，进口培养体系培养后，在优化条件转染，后续结果在公布

该产品设计也是按较高水准，近期这几个案例，也是我们在产品设计时结合原代与难转染免疫类细胞常见问题常年统计与解决过程中结合，转染常见问题全盘考虑的一个结果认定，去年初我们与几个重点室讨论的目前国内原代建系很容易，当时思路还不成熟不全面，与老师沟通也是某一个点的讨论，通过近期原代，转染，单克隆等相关问题解决与统计，目前原代建系容易，是我们已往常年问题统计与解决问题的整个思路汇总，一个小小的成绩体现。还希望后面得到各实验室技术经验指导提携。共享经验，也是后面碰到问题少走弯路一个不错的办法，提升试剂质量为目的。

原代建系参考：国内库有很多株自己建的细胞系，准备做原代建系，选择这类细胞在建系，摸些条件手法等，相对容易些，是个不错的预实验选择，这类细胞一般十几代都没问题，在这十几代中，在继续建系，相对容易，最近统计了几例，这类细胞与传统成熟细胞系培养有些差别，传统培养经验还要结合原代特性，密度抑制，通过消化传代，何时传代合适，等条件摸索出原代适合的条件。消化，冻存等枝节处，都用较稳妥可行的经验方法，在平时培养过程中要总结优出更可行的方法与经验，容错率要高，消化冻存在优化这两项我们已经开始统计了，有兴趣老师可一起讨论。

20211101：我司是该试剂研发生产单位，新方法技术突破针对免疫类，原代类转染提高效率，有兴趣老师可来信沟通，也欢迎与生物类产品生产有GMP资质北京附近公司洽谈合作，目前应用案例有中试生产相关蛋白用户（在冻干保护剂遇到瓶颈，也欢迎与国内冻干保护剂研发生产相关相关合作提携-相关研究技术老师欢迎加盟-国外这个技术相当成熟-我们上游工艺已经有不错的成绩）

20220818
细工转染试剂开发介绍
脂质体转染细胞系类较经典的试剂：
细胞系应用广泛，技术成熟。
就目前用户原代与无血清培养的细胞更娇贵，细胞质量缓冲能力差，细胞容错性差。超量培养用户需求扩大。
脂质体类应用
减毒性是细工开发相关产品的目的（与市场上大部分PEI类转染原理不同）

用户试用初期在几个难转细胞中表现还不错。因数据还不多，用户技术水平不一，所用试剂等级不一等，品牌观念等因素。

库存有五百只1ml特价销售。

细工在开发相关产品理念原料的质量严选，质高。
在普通细胞转染上应该表现突出。
欢迎老师试用采购。
下批生产会添加几个要点。
无血清细胞容错率低（常规培养中容易团聚问题解决，超量培养）
大质粒转染-50Kb以下
悬浮免疫类转染（细工提供参考POTOCOL）

量大试用理想有预付用户，我们提供凯杰提取的验证质粒5-6KB
上述难点要点有讨论的用户，建议用保种级别试剂讨论与问题解决意义积极。


学习中，ATCC定制转染试剂，不知效果如何。
难点问题异常珍贵。
（国外公司推出的几类新品都直指难点要害，问题统计重要）


新手练习细胞建系非常合适。
价格，实验要求，技术经验储备，厂家细心的详细售后服务（细节决定成败）。


筛稳转株，是我们优势，毒性低，价格合理，适合大量转染实验室，
梯度优化很重要。
转染前细胞优化技术储备足，
那些难养的，难转的，优化步骤都可讨论


要点参考简述
liver：解决团聚，正常增殖传代
breast：正常增殖传代
Pancreatic islet：胰酶消化优化
Glia cerebri：成片，锚着
Original generation:离体后处理时间，快
Serum free:缓冲弱
blood：稳妥可行培养方案，增殖较快方案建议验证细胞质量平稳性。
细工优势验证：二倍体类解决（也是上述都属于难养类）培养顺利，有些通用难点，也有各类突出要点。
路过的脂质体高手老师，多多提携啊


20230412
增强贴壁试剂处理难转细胞方法参考
（原代免疫类、原代正常类、胶质类、）
促贴壁处理培养板PBS清洗后
1. 逆转录病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。
2. 将病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。
3. 32 ℃放置4小时。
4. 吸出病毒保存液。
5. 每孔加入待转染的细胞悬液400 μl (通常细胞浓度为1 × 105/ml) 。
DNA，RNA转染用户，建议用量配比参考GIBCO-POTOCOL后，在优化。需POTOCOL来信告知。
试用发送中，使用要求，培养体系全部进口（最好是GIBCO体系，细胞可以正常传代成功率高）截止到2023年10月1日，实验满意尽量付款，成本太高了，实验照片要给我们。案例统计用（也可文章发表后再给我们也可以）试用期间用户，文章发表后，可申请我司赞助奖励，国际名流期刊的，一分一万元单独奖励。
告知细胞详情（离体后处理我们有相关总结,可讨论细节）
质粒目前推荐小于11KB，稍大质粒请注明详细要求，后面会一直统计相关难点，关键点。
无PEI成份
祝顺利


20230413
难转染，大体量转染，大质粒转染参考
难转染细胞-增强贴壁试剂辅助处理方法参考
质粒：大质粒，柔和平稳处理可行性更高
细胞：原代免疫类、原代正常类、胶质类。
讨论难点：原代首代处理（细胞质量）、团聚、成片相关细胞特性影响转染效率相关办法讨论，
例如：原代胶原酶处理贴壁不牢（上皮）成纤维胰酶处理差速贴壁筛选。EDTA消化传代处理（干细胞）
免疫类：成球，免疫保护。
二倍体细胞：顺利生长，高质量细胞状态（传代平稳前期验证）
细胞工厂大体量培养后转染优势，细胞培养增殖都有很多的相关技术储备与相关试剂开发。结合转染新方法加入，让批量转染可行性更稳妥。

20230424 
慢病毒扩增建议用我们全套DMEM，胎牛，胰酶。与您现有体系做在后续实验比较。对保种试剂级别评测的一参考建议。

20230428
无毒转染试剂开发出来后，目前转染效果无，有时间的话，任意发挥下毒性低，发挥空间很大，真对大质粒，难转细胞（更新资料有进展可发您）。传统步骤文献步骤都不建议用现状就在那，对照组建议用我们优化磷酸钙（优化了十年了），真对工业户开发的。

20240821
常见难点问题：
原代转染（目前流行反转法，需要相关资料可回信告知，细工对该类方法有些统计总结资料，该类比较适合免疫类细胞（免疫保护），其他原代影响特点关键点还没有深入了解，如果老师正在做相关实验，可告知关键点，我们从细胞培养上进行些优化调整，试剂生产上进行更新改造方式生产，技术方法上优化调整。
上述包括资料太多，简述已有解决统计资料有，细胞成团成片、黑点、生长慢都有比较成熟方案。让细胞生长正常并顺利办法较多，结合统计几大类难养细胞常年统计经验技术储备足。
大质粒转染难点痛点参考：
常规基础转染稳定，易重复先行，在上大质粒，建议先行293这类容易转染的先行，在做难养系或原代，
难养类培养顺利要先行（难养类成团成片，增殖较慢）
293培养调整到细胞较优质量后，有条件更换试剂用户，可把您的293培养条件，厂家货号列清楚，发我们细胞团片，分析后，从细胞，试剂，方法给出我司试用，不沟通细节用户不提供。
沟通前基础参数：进口体系，正规库来源细胞，
工业用户：可参考我司单克隆建系生产方式，可行性非常高，已经开始做相关工业用户案例。一年后，如用户允许后，公布案例相关参数，容错率高冗余试剂开发，在后面维持培养科研，生产，自动化培养中优势明显，试剂技术开发过程中合作公司资料全部公开，并多家实验室共同验证。是否可行结果能做到直观，易行，易重复。
目前正式开始对接细胞培养工业应用上游工艺开发，欢迎资深大佬提携并加入并合作。
方向明确：含血清，细胞工厂方案应用，相关试剂，产品开发。
转染试用索取要求：细胞名称，描述是否增殖顺利，不顺利列出试剂厂家货号，细胞来源。目前用转染试剂，及细节讨论，转染预期。
原代建系包含技术面很广，对试剂体系，技术手法经验要求高。细工每一项新产品，新技术都会结合建系为最终目的，所以有相关技术问题统计为主线，近年可提供黑点，生长慢，成瘤不稳定问题，都是来自近年原代、类器官培养中问题统计得到解决思路，并验证后理想结果后推广。

20240828
就痛点难点问题，
2021年开始列装细工目录以来，经过五个批次生产优化调整统计，新批次特点，转染试剂毒性更小，附件图片48小时-96小时不换液细胞图片，转染效果不减，可节省一半转染用量，该特点来自工业应用中大体量液体与细胞转染过程中容错率强，所以做了不换液培养统计，目前技术储备心得值得老师后面生产中参考。就是试剂种子库级别很重要，有条件尽量用大牌子，及平时问题积累解决试剂备份方案（细工所有问题都有备份方案及免费试用，给生产做冗余超强国产备份），细胞经转染后，恢复过程中，种子库级别非常重要，虽然目前转染试剂开发容错率高，转染后还是很关键的，细工在纯国内培养体系建系很是执着，最近开发简易单克隆方法、优化冻存试剂与方法，都是为建系难点提前做技术储备。转染相关高级难题，欢迎老师赏赐，
新说明书附件中-工业或细胞工厂应用、类器官、人造肉可从种子库建系开始讨论。
生产，代理有技术评测条件公司，直接讨论痛点与成本。

细工增强贴壁、转染试剂、血清等自产试剂，能够签长期供货合同组，我们提供工具细胞（全部国内正规库发货）293、293T、293FT
细胞培养相关厂家，课题组，个人，常年做一个方向用户，可参与讨论撰写SOP,精准到秒，理念一致，目的是评价出种子库应用的共享详细可行步骤，细工做试剂、耗材、可行性问题统计。给含血清培养方案拿出共享可行方案。

20240906

原代建系转染参考：（示踪重要性）
示踪质粒预实验在转染试剂比例重要
理由：转染细胞成败影响因素较多，细胞增值情况，质粒质量，构建，转染步骤等。示踪后最佳比例先固定，在找其他因素（推荐病毒建系）
转染只是搬运过程，后期表达等要求，还要看实验设计目的结果，具体问题具体分析。
转染试剂可用PBS配，因有毒性小，用量少特点，对难转细胞，可做二次转染或选择不换液方式（48-96我司已做测试，不理想用户要提供详细操作步骤，试剂厂家，预期结果，细胞名称），预实验先行，做到心中有底，冗余理念先行，转染后救助方式可深入讨论。
建系推荐病毒主动方式（质粒被动方式），高滴度优势前面已经有介绍，主要辅助是我司促贴壁试剂及维持培养。

建系目的：顺转、稳转、病毒转后，单克隆，或者反复单克隆后，细胞纯度大大提升，单克隆灵活应用参考（细胞建系后培养），原代建系后，提升细胞增殖速度，可将几堆增殖较好的汇合培养，反复汇合，提升细胞增殖速度。
建系成功后，冻存复苏方案随时可做对冻存复苏挑剔细胞先行验证，拿到准确数据后，在上实验（推荐验证三年以上冻存复苏细胞验证，我司复苏救助备份方案，促贴壁试剂方法值得一试，复苏后一代就能看到结果（细胞舒展度，锚着，可做比较，差别非常大，该方法也适合平时培养细胞逐步提升细胞质量冗余备份方法，难养类，耐药株类，自建系类，种子库类备份推荐，维持培养其他目的可详细讨论，这里不做拓展）
建系是个重要实验，对试剂，耗材，技术手法要求高，尽量用到最好标准。

20240915

自动化转染应用中，细工冗余试剂开发产品优势-转染试剂
锚着不牢，或免疫细胞可用增强贴壁试剂辅助，反向驯化，高通量处理细胞优势明显。
悬浮通过增强贴壁试剂可驯化成贴壁培养-细工建系目的（不用增强贴壁后，细胞呈悬浮原始样）
配套细工转染毒性小实验，自动化工作流程的可重复性转染（预实验为准，5次-10次）
生产目的用户参考：规模培养后转染生产用户，可参考我们建议单克隆方法，筛出高产株后，省去很多转染步骤与经费。目前相关工业应用上游开发已在进行中，预期不错。

20240915-2

冗余试剂开发及用途介绍

大厂前研主流转染试剂，反转法（免疫，原代）对难转细胞主流方法，都是促细胞锚着后，转染细胞。
为工业大面积培养后转染，需毒性低，冗余容错能力强（自动化转染已有10几次同时反复转染细胞）给难转细胞提供更多备份方案，之前对双抗，血清等影响，也慢慢开发出不用双抗血清影响的转染试剂为主流，我司就毒性小，难转细胞可反复同时转染多次，达到预期转染效果，给难转细胞提供更多备份方法。
另：转染后死细胞过多，我司提供种子库用级别水试剂。提供三个备份思路参考。
1：可免费申请使用（培养基）
2：血清用量建议加到原完全培养基比例150%，
3：上清回输，该步骤效果评测（特别是难养细胞系，原代细胞）回上清比例10%-50%有明显比全新完全培养基增值快，拿到这个预实验结果，在上转染后救助（很多难养系该方法明显有奇效，特别是胶质神经类，也可同时培养多出一组备份，专门给转染后死细胞救助用，案例用户在HEPG2细胞上已应用多年（hepg2细胞更多转染前优化，参考我司胰酶详细介绍）
建系目的用户，强烈建议参考我们推荐冻存复苏套装，原理。可用对冻存复苏挑剔细胞做比较预实验实验，跟稳妥。
自动化转染问题，冗余试剂开发统计中，欢迎老师赐难点痛点问题。

20240925

自动化培养转染中冗余试剂提前技术储备
转染后死细胞过多
转染试剂开发现状毒性越来越小，5年前10年前工艺毒性大，对血清双抗要求严格，毒性小，容错能力广，成为厂家研发方向与重点。

就转染后死细胞过多，细工在培养基，血清方面做些技术储备。
转染后的细胞对培养基PH要求更高，我们生产专门对该项指标做严格控制，可做预实验比较，如果能达到满意预期效果，这个培养基在救助死细胞过程中起到关键作用，也为自动化应用提前做相关技术储备。
该问题来源：二倍体系，原代问题常年统计，工业应用中二倍体培养体系普通实验室较难达标，常规系容错能力很高，长期培养后，也会形成培养室自身特点。建议实验室库有纯国产培养体系备份，并长期验证。
血清：种子库级别试剂，我们平时验证对标国内正规库来源细胞长期验证，特别是较难养的（各类难养的乳腺，肝，胰岛胰腺，免疫类系长期验证），转染后死细胞过多方法，建议按原指标血清用量提升5%，更多营养补充，救助转染过程中损伤救助。
耗材：以上验证尽量用进口耗材，难养系分类较多，各有各的特性细节都可讨论沟通，建议给出原始细胞图片，现细胞图片，培养体系厂家，货号。都会得到细工全套免费试用小包装验证。
就自动化培养，转染，细工简易单克隆方法可共享potocol,及后面问题可讨论，讨论前细胞生长特性，准确的目的需求要沟通。

20241001

难转染建议：该试剂毒性小，常规用量减半，包裹转染物更均匀，增加转染效率（难转）,同时可反复转染15次，双质粒，多质粒，超大质粒设计时可多设计几款适合转染质粒大小转染后死细胞过多细工方案参考：
     细工冗余优化胰酶，对细胞膜无损。
     种子库级别培养基（pH生产要求高），如果救助效果凸显，建议加入种子库级别试剂筛选项
     血清质量与用量，常年问题解决试剂储备，在转染后细胞救助参考用量15%
自动化冗余试剂
增强贴壁试剂
转染试剂
优化胰酶
冻存复苏优化推荐
解离培养基
简易单克隆
配套国内种子库，二倍体生产科研一步到中式。自动化转染培养问题开始统计。
自建系优化，您自建系培养要时增殖很困难，细工冗余试剂加经验可讨论。

20250611

转染后死细胞过多救助参考
1：团聚特点：原代，上皮，老手习惯大部分等待细胞长满后，消化（胰酶加吹打）成单个，该类问题点参考，细胞老幼状态并存导致，根据细胞生长特性，小克隆时提前消化成单个传瓶，避免老幼状态形成，培养过程中逐步有细胞漂浮贴壁并存就是这类特性，也可用细工简易单克隆方法，更新种子库细胞质量，团聚问题解决后，转染，冻存复苏后细胞活率都有不少提升。
2：难转染共同特性，上皮类，SV40(肝，乳腺，胰岛胰腺，免疫悬浮系难养大部分是这个建系），上清回输培养我司统计十几年经验，大部分比全新上清增殖快，也可用该方法救助转染后死细胞过多问题，推荐平时细胞培养做预实验提前验证上清回输验证增殖效果，拿到确切数据后，就当转染后救助备份方案。原代建系，耐药株建立等很多高难度实验都可备份该方案。
3：目前转染试剂都往毒性小方向开发，大质粒设计的可做拆分质粒，自动化转染-反复转染国外有些应用了，转染方面细胞质量优化都可深入讨论。