Amplex Red胆固醇与胆固醇酯检测试剂盒

碧云天研发的Amplex Red胆固醇与胆固醇酯检测试剂盒(Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、组织或细胞样品、尿液、细胞培养上清等样品中游离胆固醇、总胆固醇和胆固醇酯含量进行检测的试剂盒。通常0.5-5μl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒采用吸光度检测时，在5-500μM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在0.5-50μM浓度范围内有良好的线性关系。使用本试剂盒进行荧光法检测时，检测灵敏度会显著提高，可以使用更少量的样品。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒不仅可以用荧光检测，也可以用吸光度检测，荧光检测比吸光度检测灵敏度约高10倍。整个检测过程约30分钟即可完成。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织或细胞样品的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

胆固醇(Cholesterol)，又称胆甾醇，是一种环戊·烷多氢菲的衍生物，分子式为C27H46O，分子量为386.6535。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也比较高。胆固醇的溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于yi·   醚、氯仿等有机溶剂。胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)。在血液中存在的胆固醇绝大多数都是和脂肪酸结合的胆固醇酯(Cholesteryl ester)，仅有少量的胆固醇是以游离状态存在的。

胆固醇是动物组织细胞不可缺少的重要物质，它不仅是哺乳动物细胞膜的重要组成部分，同时也是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的重要原料。胆固醇广泛参与胞内转运、细胞信号转导等细胞功能，并维持着膜结构的流动性[1-2]。在正常情况下，机体在肝脏中合成或从食物中摄取的胆固醇，转化为甾体激素或成为细胞膜的组分，并使血液中胆固醇的浓度保持相对稳定。当肝脏发生严重病变时，血液胆固醇浓度会降低。而在黄疸性梗阻和肾病综合征患者体内，血液胆固醇浓度往往会升高。高密度脂蛋白有助于清除细胞中的胆固醇，而低密度脂蛋白超标一般被认为是心血管疾病的前兆。由于血液总胆固醇含量的升高与动脉粥样硬化、心血管疾病存在一定的关联性[3]。所以对血液中胆固醇含量进行检测具有重要的临床意义。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用荧光和吸光度两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理如图1所示。胆固醇酯(Cholesteryl ester)首先在胆固醇酯酶(Cholesterol esterase)的催化作用下水解生成游离胆固醇(Free cholesterol)和脂肪酸(Fatty acids, FA)，游离胆固醇进一步在胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase, Cho)的作用下和氧气发生氧化反应生成H2O2和胆甾烯酮(Cholestenone) ，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵的荧光强度或吸光度来最终检测总胆固醇的含量。试卤灵的荧光强度和吸光度与胆固醇的含量成正比。如果检测时不使用胆固醇酯酶，那么检测出来的就是游离胆固醇的含量。测定出总胆固醇和游离胆固醇的含量，二者相减就可以计算出胆固醇酯的含量。

图1.碧云天Amplex Red胆固醇与胆固醇酯检测试剂盒(S0211)检测胆固醇与胆固醇酯的原理图。

本试剂盒提供了胆固醇标准溶液，可以通过设置标准曲线，从而计算出样品中的胆固醇、胆固醇酯和总胆固醇含量。本试剂盒对胆固醇标准品的检测效果参考图2。

图2.碧云天Amplex Red胆固醇与胆固醇酯检测试剂盒(S0211)检测胆固醇的标准曲线。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本产品采用吸光度检测时，在5-500μM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在0.5-50μM浓度范围内有良好的线性关系。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供了便捷的检测裂解液。对于细胞或组织样品的制备，可以用本试剂盒提供的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay，也可以用异丙醇、甲醇/氯仿(1:2, v/v)等有机溶剂。经测试发现，本试剂盒提供的检测裂解液所制备样品的检测效果与异丙醇或甲醇/氯仿(1:2, v/v)所制备的样品的检测效果相当。使用异丙醇制备的细胞或组织样品，还可以用于甘油三酯、甘油和游离脂肪酸的检测，因此优先推荐使用异丙醇。如果样品仅用于检测胆固醇、胆固醇酯和游离脂肪酸的检测，不用于甘油三脂和甘油的检测，优先推荐使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay。如果使用异丙醇或者甲醇/氯仿(1:2, v/v)所制备的样品，样品最终用异丙醇溶解后，样品检测时如果异丙醇的体积不超过整个检测体系的10% (即100μl检测体系中不超过10μl)，不会对吸光度或荧光检测产生显著影响。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

按照使用说明操作，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red、酶混合物、胆固醇标准溶液须避光保存。

本试剂盒如果用于细胞或组织样品的检测，可以用试剂盒提供的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或自备的异丙醇、甲醇/氯仿(1:2, v/v)进行样品的制备。优先推荐使用异丙醇。用异丙醇制备的细胞或组织样品，可以用于胆固醇和胆固醇酯、游离脂肪酸、甘油三酯和甘油的检测。如果样品仅用于检测胆固醇和胆固醇酯、游离脂肪酸的检测，优先推荐使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay。为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，标准品的稀释液应该根据样品制备所用的溶液来确定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释；当样品为异丙醇制备的细胞或组织样品时，可以使用和样品中异丙醇含量相同的胆固醇检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)稀释；当样品为血液等其它样品时，宜使用检测缓冲液稀释。

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中一定要注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或类似还原剂的浓度应低于10μM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay和检测缓冲液需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂(除胆固醇标准溶液(5mM)外)使用时应在冰上进行。

胆固醇标准溶液如果有油脂析出会影响后续反应，需要在50-80ºC水浴孵育20分钟，使胆固醇标准溶液完全溶解。胆固醇标准溶液配制在无水乙醇中，由于无水乙醇容易挥发，水浴溶解过程中请注意密封。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

当样品为细胞或组织的异丙醇抽提物或溶解物时，应使用检测缓冲液至少稀释5倍，使50μl样品中的异丙醇含量不高于20%，即相当于总的100μl检测体系中异丙醇的含量不高于10%，此时本试剂盒才能正常工作。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。