货号：B0014
存储条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。
产品组分：
组分 | 20T | 50T |
A. YF®594 TUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2 × 1.25 mL |
B. TdT Enzyme | 20 μL | 50 μL |
C. Proteinase K (2 mg/mL) | 40 μL | 100 μL |
D. DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
E. 10 × DNase I Buffer | 100μL | 260 μL |
产品介绍
细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。本试剂盒应用范围广，可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。
使用方法
实验材料（自备）
PBS 缓冲液（1x，pH~7.4）
0.2% Triton X-100（PBS配制）
0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）
4% 多JU甲QUAN（PBS 配制）
ddH2O
实验设计
A. 阳性对照：
DNase I处理制备阳性对照。DNase I可以消化单链或双链DNA暴露3'-OH末端，人为造成细胞凋亡。每次实验做一次即可。（用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题）
B. 阴性对照：
使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代TdT Enzyme。（主要是排除细胞自身凋亡、操作过程等原因导致的非特异性染色；以及调整拍摄曝光强度。）
C. 实验处理组。
实验组按照说明书正常操作。
D. 实验对照组。
实验组按照说明书正常操作。
实验步骤
1. 样本准备：
(1) 对于贴壁细胞
a. PBS清洗1次。
b. 固定：加入适量4%多JU甲QUAN（PBS配制），4℃固定30 min。PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.2% Triton X-100（PBS配制），室温通透20 min。PBS清洗2次。
d. 转步骤2. TUNEL 反应。
(2) 对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞（3-5×106个细胞），1000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
b. 固定：加入适量4%多JU甲QUAN（PBS配制）充分重悬细胞，4℃固定30 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.2% Triton X-100（PBS配制），室温通透20 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
d. 转步骤2. TUNEL 反应。
(3) 阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤）
a. 按1: 10的比例用ddH2O将10× DNase I Buffer稀释成1× DNase I Buffer备用。
b. 滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已处理的样本上，覆盖全部样本区域，室温平衡5 min。
c. 用1× DNase I Buffer以1: 100稀释DNase I (2 U/μL)至终浓度20 U/mL的工作液。
d. 弃去Buffer，加入100 μL浓度为20 U/mL的 DNase I工作液，室温孵育10 min。
e. 弃去DNase I工作液，PBS清洗2次。
f. 转步骤2. TUNEL 反应。
2. TUNEL 反应
(1) 配制TUNEL反应液（即用即配）：
工作液配方 | 1个样本 | 5个样本 | 10个样本 |
TdT酶 | 1 μL | 5 μL | 10 μL |
YF®594 TUNEL Reaction Buffer | 49 μL | 245 μL | 490 μL |
TUNEL反应液总体积 | 50 μL | 250 μL | 500 μL |
(2) 对于贴壁细胞
a. 每个样本加入50 μL TUNEL反应液，使反应液均匀覆盖样本。37℃避光孵育适宜的时间（细胞推荐染色时间30 min-1 h）。
注：50 μL TUNEL反应液适合96孔板（其他不同孔板可以适当调整TUNEL反应液体积，覆盖细胞即可）。如果待检测的样品在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL反应液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL反应液蒸发，并且使TUNEL反应液均匀覆盖样本。
b. 弃去TUNEL 反应液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗3次，每次 5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c. （可选）每个样本加入适量浓度为5 μg/mL 的DAPI染液，室温避光孵育5 min。染色完成后，弃去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5 min。
d. 向样本区域加100 μL PBS保持样本湿润，立即在荧光显微镜下观察。
(3) 对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 每个样本管加入50 μL TUNEL反应液轻轻重悬细胞，37℃避光孵育30 min~1 h。每隔15 min用微量移液器轻轻重悬细胞。
b. 2000 rpm 离心5 min，弃去TUNEL 反应液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗2次，每次 5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c. （可选）每个样本管加入100 μL浓度为5 μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。
d. 加入400 μL PBS重悬细胞，立即用流式细胞仪检测或进行涂片后在荧光显微镜下观察。
注意事项
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。
2. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。
3. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本产品只适用于细胞样本染色，若您检测的样本为切片可选择通用型 Tunel试剂盒。
