描述：MTT四唑蓝是一种能接受氢原子的染料，在细胞培养基中可被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的深紫色结晶状产物Formazan，但死亡细胞不能进行此还原反应。用特定溶剂溶解MTT所产生的水不溶性紫色结晶，然后用酶标仪在570 nm波长附近(500~600 nm)测定光吸收值，可反映活细胞的数量和代谢活力，并由此反映出细胞的存活、增殖、生长和毒性等状态。例如，加入细胞生长因子后，增殖生长旺盛的细胞将还原更多的MTT，并具有较高的光吸收度；反之，抗增殖抗肿瘤或细胞毒药物处理后，细胞生长变慢或毒性变大，光吸收度下降。该方法也可用于检测非药物刺激，如物理因素对细胞增殖和活力的影响。与3H-胸腺嘧啶掺入方法相比，简便快速可靠，不使用放射性同位素，广泛用于检测细胞存活、增殖、生长、毒性实验(1)。
组成与储存 ：(500 次)
1. MTT Stock: 5 ml，−20ºC 12个月有效 2. MTT 溶解剂: 50 ml, 室温保存 12个月有效
所需仪器：酶标仪，96孔培养板。
使用方法：
- 使用与酶标仪匹配的96孔培养板。测定细胞增殖时，建议每孔加100微升(约含2000个细胞左右)，测定细胞毒性每孔加100微升（约含5000个细胞左右），应根据所用的细胞类型、增殖速度进行调整。注意设置2-3个重复孔，分别为接受处理细胞，未处理细胞对照、无细胞培养基对照。37 ºC培养细胞24-48小时，然后给予特定的药物或物理因素刺激。
- 处理结束后，每孔每100 µl培养基加入10µl MTT Stock，37 ºC培养箱内继续孵育4小时。也可更换100 µl新鲜无血清培养基后再加MTT Stock。 样品数多时，可将MTT Stock与培养基预先混合后加入。
- 溶解：(a) 如果细胞贴壁良好，可吸除培养基，然后每孔加入100µl MTT 溶解剂，此时应注意 保持各孔内液体容积一致。37 ºC培养箱内继续孵育4小时。
- 在570nm测定OD吸光度并进行比较计算。如无570nm滤光片可用500-600nm范围内的滤光片。注意：为准确考虑可在699 nm处测定未还原的MTT本身的吸光度OD值， 然后用OD570减去OD699。这在进行3(b)操作时尤为必要。
- 结果判断：细胞增殖或毒性＝100％ x (OD实验－OD本底) / (OD对照－OD本底)。
DATA INTERPRETATION：
Absorbance values that are lower than the control cells indicate a reduction in the rate of cell proliferation. Conversely a higher absorbance rate indicates an increase in cell proliferation. Rarely, an increase in proliferation may be offset by cell death; evidence of cell death may be inferred from morphological changes.
说明 ：
- 在进行培养或检测反应时，为避免培养基应蒸发体积减少，可用封口膜部分封闭培养板。
- 微生物污染将导致测定结果不准确。另外，如果MTT Stock由黄色变灰绿色应弃去。MTT Stock可预先稀释于培养基中配制成工作液，通常在4ºC一周内稳定。
- 对于使用方法的第三步骤，溶解这一步，为了能够更节省时间，可以用DMSO来代替MTT 溶解剂，室温孵育10分钟，稍微震荡下就可以检测。
- 可在非96孔板进行MTT Assay，需要成比例加大反应体系。反应后用比色杯测定OD。
- 浓度高于10%血清将降低灵敏度。使用不含酚红的培养基将使灵敏度提高约20%。
1. Mossman, T. (1983) J. Immunol. Methods 65:55.
