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产品名称：猪流行性腹泻病毒/传染性胃肠炎病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒
规 格：50T/盒
反应体积：25μL
试剂类型：液体
【检测原理】本试剂盒根据荧光 PCR 技术原理，针对 PCR试剂盒设计特异性引物和 Taqman 探针，通过荧光 PCR 检测仪进行检测，从而实现对 PCR试剂盒的检测。
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，对养猪业的危害极大，所以及早确诊对该病的防治具有特别重要的意义。猪流行性腹泻病毒的传统诊断方法主要有病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体试验、免疫电镜观察和ELISA等方法。但这些方法操作过程繁琐、操作难度大，所需要时间较长，专一性不强因此建立一种快速、高灵敏度的诊断方法对防治PEDV感染是十分必要的。
PEDV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，其基因组为单链正股RNA，其中膜蛋白(M)基因高度保守。本研究根据PEDV的M基因设计特异性检测引物，提供了PEDV的快速、灵敏的鉴别诊断方法，采用RT-PCR技术检测疑似感染仔猪粪便或肠道组织样品中的PEDV。
【使用方法】
一、试剂准备（在试剂准备区进行）
1. 取出包装盒中的各组分，室温放置，待其完全融化，混匀后备用。
2. 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按下表1单反应体系配制方法，取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，按照20 μL/反应分装到PCR反应管中，瞬时离心后备用。
表1：单反应体系配制方法
试剂 | 反应液 | 混合酶 |
用量 | 19 μL | 1 μL |
二、样本准备（在样本准备区进行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取试剂盒，参照说明书进行操作，提取好的核酸样本如不能立即检测，建议-70℃以下保存。
2. 取出样本后混匀，将阴性对照、待测样本、阳性对照各5 μL加入到PCR反应管中混匀。
3. 盖上管盖，2000 rpm离心30秒。
4. 将PCR反应管转移到扩增区进行上机。
三、PCR（在核酸扩增区进行）
1. 将上述PCR反应管按照实验布局依次放入PCR仪对应检测孔内，并记录顺序。
2. 按表2设置PCR扩增循环参数。
表2：PCR扩增相关参数
体系 | 反应体系设为25 μL | ||
信号采集 | 选择FAM通道检测H5亚型； 选择CY5通道检测H7亚型； 选择ROX通道检测H9亚型。 | ||
PCR 反应 条件 | 阶段 | 条件 | 循环数 |
逆转录 | 50℃：30 min | 1 | |
预变性 | 95℃：5 min | 1 | |
PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
60℃：30 sec （此阶段结束时采集荧光信号） | |||
【结果分析】
表3：结果分析表
实验成立 条件 | 阴性对照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。 |
阳性对照 | 三通道Ct≤30且出现典型的S型扩增曲线。 | |
样本结果 判定标准 | H5亚型 阳性 | FAM通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 |
H7亚型 阳性 | CY5通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 | |
H9亚型 阳性 | ROX通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 |
结果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建议复测，复测结果仍为可疑，且出现明显指数增长，判为阳性。否则为阴性。 |
结果阴性 | Ct＞38或者No Ct，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。 |
【注意事项】
1. 使用本试剂盒的实验室，应严格按照国家有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理。
2. 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁消毒。
3. 吸取反应液时，应尽量避免产生气泡。上机前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确。
4. 检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有10%次氯酸的废液缸内，检测结束的PCR反应管，切忌开盖，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
5. 工作台及各种实验用品应定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外灯进行消毒。
6. 试剂使用前应在常温下充分融化并混匀。不同批号的试剂请勿混用，并在有效期内使用。
【储存条件与有效期】
试剂盒应置于-20℃冷冻避光贮存；
试剂盒保存有效期为12个月；
试剂盒反复冻融次数不宜超过5次。
