GBclonart 无缝克隆试剂盒

GBclonart 无缝克隆 ( Seamless Cloning ) 是一种新的、快速、简洁的克隆方法。传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。GBclonart无缝克隆和组装技术旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片段的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。它可以为您解决克隆方面的技术困扰，提高您的工作效率，让您的工作变得轻松高效。

特点：
1.灵活的位点选择：可以在载体的任意位置进行基因克隆
2.快速简便：30分钟完成载体构建
3.精确：不需要增加任何额外的程序
4.克隆效率高：高达90%阳性克隆

适用范围：
1. 载体DNA片段克隆
2. 载体DNA转移
3. 高通量克隆

GBclonart 流程图：


GBclonart操作流程 ：

	A. 载体制备--线性化处理
	1. 酶切法 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，但是单酶切容易 导致载体自连，载体线性化不彻底容易导致假阳性的产生。为了降低自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切，而且对酶切后的载体进行割胶纯化。
	2. PCR法 选取合适的位点，设计正向和反向引物，建议采用高保真的DNA聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议对PCR扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。
	B. 目的插入片段制备 设计引物进行目的片段的PCR扩增，引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与线性化载体的两端一致便于重组反应的进行。PCR每条引物长度至少在35-40bp,包括5’端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp。 （注意：如果是表达载体克隆构建,设计引物时,应注意检查读码框的正确性。引物的质量对克隆成功率有很大影响，请使用HPLC或PAGE纯化的引物。尽可能选用Pfu等高保真酶，同时建议对PCR产物进行割胶纯化。）
	C. 重组反应
	1: 将目的DNA片段和线性化载体以适当摩尔比加到试管中进行反应，载体的用量为50-100ng。 （注意： 目的片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间最佳，否则会降低载体与目的片段的重组效率，反应时间30分钟，时间过长或过短均不利于重组反应。） 反应体系如下：
	GBclonart反应液 15 μl 线性化载体 x μl PCR片段 x μl H2O x μl 总体积 20 μl
	2. 混匀后在45 ℃水浴锅或PCR仪中放置30min，然后转移到冰上。
	3. 立即进行感受态细胞转化实验，剩余反应液可保存在-20 ℃待用
	D. 转化 1. 从-80℃取出一支含有100μl的感受态细胞的管子，冰上溶化。 将5μl反应液加入至100μl感受态细胞中，冰上继续放置5分钟。 2. 42℃水浴1分钟， 然后返回冰上放置2分钟。 3. 加入400μl不含抗生素的LB或SOC， 37℃震荡培养60分钟左右。 4. 将上述200μl感受态细胞均匀铺在含有抗生素的LB盘子上， 37℃温箱过夜。第二天，挑3--5个克隆进行检验。

引物设计：

如果线性化载体由酶切产生，根据酶点位置的不同设计引物，以下为三种常见引物设计方法：