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GBclonart无缝组装试剂盒提供了一种新颖、高效、快速的基因组装方法，只需相邻的DNA首尾之间与载体两端具有大约15-25个同源碱基序列，就可以在载体的任意位点完成多个目标DNA片段的克隆重组，不需要任何限制性内切酶和连接酶。当DNA片段较长不易扩增时，可将长片段分解为多个短片段分别扩增，各片段首尾重叠大约15-25bp，再利用本试剂盒连接成一个长片段。
特点：
1.灵活的克隆位点：任何载体的任意位置。
2.快速简便：30分钟完成载体构建。
3.精确：不会增加任何额外的程序。
4.效率高：高达90%阳性克隆率。
操作过程：
| A. 载体制备--线性化处理 | ||||||||||||
| 1. 酶切法 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，但是单酶切容易导致载体自连，载体线性化不彻底容易导致假阳性的产生。为了降低自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切，而且对酶切后的载体进行割胶纯化。 | ||||||||||||
| 2. PCR法 选取合适的位点，设计正向和反向引物，建议采用高保真的DNA聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议对PCR扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。 | ||||||||||||
| B. 目的插入片段制备 设计引物进行目的片段的PCR扩增，引物设计要保证目的片段两端有至少20bp序列与线性化载体的两端一致便于重组反应的进行。PCR每条引物长度至少在40-45bp,其中包括5’端与载体同源的20bp以及目的片段特异性序列20-25bp（注意：如果是表达载体克隆构建, 设计引物时,应注意检查读框的正确性）。引物的质量对克隆成功率有很大影响，请使用HPLC或PAGE纯化的引物。尽可能选用Pfu等高保真酶，同时建议对PCR产物进行割胶纯化。 | ||||||||||||
| C. 重组反应 | ||||||||||||
| 1: 将目的DNA片段和线性化载体以适当摩尔比加到试管中进行反应，载体的用量为50-100ng（注意：目的片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间为最佳，摩尔比过高或过低均会降低载体与目的片段的重组效率，反应时间30 min，时间过长或过短均不利于重组反应）。反应体系如下： | ||||||||||||
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| 2. 混匀后在45 ℃水浴锅或PCR仪中放置30min，然后转移到冰上。 | ||||||||||||
| 3. 立即进行转化，剩余连接液可保存在-20 ℃待用 | ||||||||||||
| D. 转化 1. 从-80℃取出一支含有100μl的感受态细胞的管子，冰上溶化。 将5μl反应液加入至100μl感受态细胞中，冰上继续放置5分钟。 2. 42℃水浴1分钟， 然后返回冰上放置2分钟。 3. 加入400μl不含抗生素的LB或SOC， 37℃震荡培养60分钟左右。 4. 将上述200μl感受态细胞均匀铺在含有抗生素的LB盘子上， 37℃温箱过夜。第二天，挑3--5个克隆进行检验。 | ||||||||||||
GBclonart引物设计要点：
GBclonart 基因组装的引物设计及目的DNA 片段的扩增与常规PCR 法大致相似，关键在于所设计的引物能够使相邻 PCR 片段之间，或 PCR 片段与载体的两端具有大约15-25bp 的同源碱基。
1. 根据线性化载体末端的不同类型进行引物设计：
2. 连接相邻的DNA 片段时所使用的引物设计：
在连接两个相邻的DNA 片段时，所需的15-25bp同源性序列可以由正向引物和反向引物共同提供。下图显示了DNA 片段1 的反向引物和片段2 的正向引物分别提供9bp和9bp 的同源重组所需的18bp。粗体字母显示引物所含的同源性序列，引物的3’端则为目的基因序列。
